Введение
Глава I. Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутриклеточной сигнализации на примере белка RACK1 9
1.1. Введение. 9
1.2. Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала . 10
1.3. Экспрессия чужеродных белков ъЕ.соИ. 17
1.3.1. Генетические элементы экспрессирующего вектора. 17
1.3.2. Компартментализация продуцируемого белка. 35
1.3.3. Экспрессия правильно сворачивающихся белков в Е. coli. 37
1.3.4. Химерные белки. 44
1.4. Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии . 46
Глава II. Получение бактериального суперпродуцента- рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции.Резулътаты и обсуждение . 50
2.1. Принцип и дизайн системы генетической селекции. 50
2.2. Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM 53
2.3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину Tetr в плазмиду PGEM-C2. 58
2.4. Схема введения рандомизованного фрагмента. 60
2.5. Проведение генетической селекции в одноцистроннои системе. 62
2.6. Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2 . 64
2.7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцистроннои системы (RBS-Tet) в двуцистронной конструкции, содержащей rack\. 66
2.8. Контрольная конструкция для экспрессии RACK1 в двуцистронной системе. 69
2.9. Введение рандомизованного фрагмента в двуцистронную конструкцию pGCT-RACK1. 71
2.10. Искусственный отбор и анализ отдельных клонов. 73
2.11. Тестирование области инициации трансляции из клона-суперпродуцента в исходном векторе pGCT2. 76
Глава III. Материалы и методы. 78
3.1. Реактивы. 78
3.2. Ферменты. 78 3.3 Материалы. 79
3.4. Препараты. 79
3.5. Олигонуклеотиды, 79
3.6. Штаммы и векторы. 81
3.7, Лабораторное оборудование. 81
3.8, Буферы и растворы. 81
3.9, Методы. 83
Выводы. 97
Список литературы. 98
