Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов 12
1.2. Биологическая деструкция ПАУ 15
1.3. Биохимические пути метаболизма ПАУ бактериями 19
1.3.1. Биохимические пути биодеградации нафталина 19
1.3.2. Биохимические пути деградации фенантрена 26
1.4. Разнообразие бактериальных генетических систем деградации ПАУ 29
1.4.1. Гены катаболизма ПАУ грам - отрицательных бактерий 29
1.4.1.1. Организация генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7 29
1.4.1.2. Регуляция генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7 30
1.4.1.3. Генетические системы катаболизма нафталина аналогичные nah-тенш плазмиды NAH7 31
1.4.1.4. Генетические системы катаболизма нафталина, отличающиеся от архетипа плазмиды NAH7: 35
а) рЫ-геиы Comamonas testosteroni 35
б) nag-гены Ralstonia sp. штамм U2 36
в) р/ш-гены Burkholderia sp. RP007 37
г) гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingomonas 39
д)р/ш-гены Cycloclasticus sp. А5 39
1.4.2. Гены катаболизма ПАУ грам - положительных бактерий 41
1.4.2.1. war-гены бактерий рода Rhodococcus 41
1.4.2.2. Организация генов катаболизма фенантрена Nocardioides sp. КР7 41
1.5. Участие плазмид в биодеградации ПАУ 42
1.6. Пути эволюции генетических систем катаболизма ПАУ 44
2 Материалы и методы 49
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 49
2.2. Питательные среды и условия роста 53
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 53
2.4 Выделение тотальной ДНКбактерий 54
2.5. Выделение плазмидной ДНК 54
2.6. Коньюгационный перенос шгазмид 55
2.7. Полимеразная цепная реакция 56
2.8. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 58
2.9. Электрофорез в агарозном геле 58
2.10. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 59
2.11 Мечение ДНК методом рассеянной затравки 59
2.12 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах 59
2.13. .Цитирование ДНК 60
2.14. Приготовление компетентных клеток E.coli 60
2.15 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 61
2.16 Определение нуклеотидной последовательности ДНК 61
2.17 Определение удельных активностей ферментов 62
3. Результаты 64
3.1. Изоляция и характеристика штаммов- деструкторов нафталина 64
3.2. Генотипический анализ штаммов P. fluoresceins 65
3.3. Участие плазмид в генетическом контроле деградации нафталина и фенантрена 67
3.4. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата 69
3.5. Амплификация и RFLP - анализ ключевых генов биодеградации нафталина 72
3.6.Анализ генов nahAc штаммов-деструкторов нафталина 76
3.7. Анализ генов nahG штаммов-деструкторов 79
3.8. Салицилат 5-гидроксилаза в штамме P. putida АК5 83
3.9. Амплификация регуляторного гена nahR 85
3.10. Амплификация генов орто- и мета- пути деградации катехопа 86
3.11. Анализ штаммов на наличие плазмид биодеградации нафталина 1псР-9 группы 87
3.12. Геномный фингерпринт (rep-PCR) штаммов-деструкторов нафталина, содержащих Р-9 плазмиды 90
3.13. RFLP - анализ плазмид 0 и 5 -подгрупп Р-9 группы несовместимости 90
3.14. Анализ штаммов - деструкторов нафталина на наличие плазмид ЬісР-7 группы 92
3.15. Локализация генов биодеградации нафталина в штаммах - хозяевах шсР-7 плазмид 94
3.16. RFLP - анализ 1псР-7 плазмид 94
4. Обсуждение 96
Выводы 111
Список литературы 112
