Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Общее строение и характеристика вириона вируса гриппа А . 15
1.2. Характеристика генома вируса гриппа. Функции вирусных белков вируса гриппа А 18
1.2.1. Сегменты РНК 1, 2, 3. Гены, кодирующие Р-полипептидьт . 19
1.2.2. 5-ый сегмент РНК кодирует нуклеокапсидный белок 20
1.2.3. 4-ый и 6-ой сегменты РНК кодируют соответственно белки гемагглютинин и нейраминшшу 21
1.2.4.7-ой сегмент РНК кодирует матриксный белок Ml и транс мембранный белок М2 26
1.2.5 8-й сегмент РНК кодирует неструктурный белок NS1 и белок ядерного экспорта NS2 (NEP) 28
1.3. Молекулярные основы антигенной изменчивости вируса гриппа А при эпидемическом процессе 30
1.4. Картирование антигенных участков (сайтов) в трехмерной структуре гемагглютинина вируса гриппа А разных подтипов 38
1.5. Влияние структурных изменений гемагглютинина вируса гриппа А на его функциональные свойства 43
1.6. Вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н9, как возможные агенты будущих пандемий 53
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1. Экспериментальные методы 61
2.1 1. Использованные в работе вирусы 6і
2.1.2 Адаптация вируса к репродукции в легких мышей 62
2.1.3. Панель моноклональных антител (МКАТ) 62
2.1.4. Селекция escape-мутантов 63
2.1.5. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) 65
2.1.6. Концентрация и очистка вируса 65
2.1.7. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА) 65
2.1.8. Определение сродства гемагглютинина к сиалосодержащим субстратам 66
2.1.9. Титрование инфекционное вирусов на куриных эмбрионах 67
2.1.10. Определение летального эффекта вирусов для мышей . 68
2.1 1 1. Реакция нейтрализации инфекционности 68
2.1.12. Метка белков 14С-гидролизатом хлореллы в зараженных клетках 68
2.1.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 69
2.1 1.4. Радиоиммунопреципитационный анализ 69
2.1.1 5. Выделение вирусной РНК 70
2.1.16. Получение вирусной кДНК 71
2.1.17. Полимеразная цепная реакция 72
2.1.18. Электрофорез в агарозном геле 72
2.1.19. Автоматическое секвенирование 73
2.2. Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей 74
2.3. Статистическая обработка результатов. Вычисление ошибки эксперимента 74
Глава 3. Результаты 75
3.1. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Ы5 75
3.1 1 Получение одиночных, двойных и тройных escape-мутантов подтипа Н5
3.1.2. Характеристика escape-мутантов подтипа Н5 в перекрестных иммунологических реакциях (РТГА и ТФИФА) с панелью моноклональных антител 76
3.1.3. Секвенирование генов гемагглютинина escape-мутантов подтипа Н5 82
3.1.4. Построение трехмерной структуры гемагглютинина подтипа Н5 85
3.1.5. Роль дополнительного сайта гликозилирования в блокировании связывания молекулы гемагглютинина с МКАТ . 88
3.2. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9 92
3.2.1. Адаптация вируса A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) к репродукции в легких мышей 92
3.2.2.Получение одиночных и двойных escape-мутантов подтипа Н9 94
3.2.3. Характеристика escape-мутантов подтипа Н9 в перекрестных иммунологических реакциях (РТГА и ТФИФА) с панелью моноклональных антител 97
3.2.4. Секвенирование генов гемагглютинина escape-мутантов подтипа Н9 104
3.2.5. Построение трехмерной структуры НА подтипа Н9 109
3.3. Фенотипическая характеристика escape-мутантов подтипов Н5иН9 112
3.3.1. Вирулентность escape-мутантов подтипов Н5 и Н9 112
3.3.2. Аффинность гемагглютинина escape-мутантов подтипов Ы5 и Н9 к сиалосодержащим субстратам 117
Глава 4. Обсуждение 126
Выводы 139
Список литературы 141
