Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Определение и классификация РИБ 10
1.2. Токсины из растения омела белая (Viscum album L.) 12
1.3. Строение вискумина 14
1.3.1. Строение А-субъединицы вискумина 15
1.3.2. Строение В-субъединицы вискумина 15
1.3.3. Взаимодействие между субъединицами вискумина 18
1.3.4. Димеризация вискумина 19
1.4. Ферментативная активность РИБ 20
1.5. Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза 22
1.6. Биосинтез РИБ в растительных клетках 25
1.7. Физиологическая роль РИБ в растениях 28
1.8. Транспорт РИБ її в эукариотических клетках 32
1.9. Применение РИБ в медицине 35
1.9.1. Биологическая активность экстрактов омелы и их компонентов 36
1.9.2. Иммунотоксины и вакцины на основе РИБ 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Штаммы бактерий, плазмиды, ДНК-модифицирующие ферменты и реактивы .44
2.2. Выделение нативных токсинов и их субъединиц из растения Viscum album L...44
2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Ricinus communis 45
2.4. Выделение геномной ДНК из растения Viscum album L 46
2.5. Клонирование гена предшественника лектина омелы 47
2.6. Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединнцу токсического лектина омелы 49
2.7. Клонирование фрагмента гена, кодирующего В-субъединицу токсического лектина омелы 50
2.8. Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов 50
2.9. Предсказание антигенных детерминант в А- и В-субъединицах МЫ и MLIII ..51
2.10. Экспрессия рекомбинантных белков 52
2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков 52
2.12. Ренатурация рекомбинантных белков 54
2.13.Иммуноблоттинг 54
2.14. Иммуноферментный анализ (ИФА) 55
2.15. Бесклеточная система синтеза белка 56
2.16. Оценка углевод-связывающей способности рекомбинантных белков 56
2.17. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII с помощью сайт-направленного мутагенеза 57
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 61
3.1. Клонирование гена и Анализ последовательности предшественника токсического лектина омелы 61
3.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы 61
3.1.2. Анализ аминокислотной последовательности А-субъединицы токсического лектина омелы 66
3.1.3. Анализ аминокислотной последовательности В-субъединицы токсического лектина омелы 71
3.2. Получение рекомбинантных субъединиц токсического лектина омелы и исследование их активности 80
3.2.1. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических пектинов омелы 80
3.2.2. Предсказание антигенных эпитопов в А-субъедницах МЫ и MLIII 83
3.2.3. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной В-субъединицы токсического лектина омелы 89
3.2.4. Предсказание антигенных эпитопов в В-субъедницах МЫ и MLIII 94
3.2.5. Исследование каталитической активности рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы MLI и MLIII 97
3.2.6. Исследование углевод-связывающей способности рекомбинантной В-субъединицы токсина омелы MLIII 99
3.3. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII 101
Выводы 106
Список литературы 107
