Введение
1. Строение и функционирование наружного сегмента палочки сетчатки позвоночного 14
1. Морфология фоторецепторной клетки. Электрический ответ фоторецептора 14
2. Медиаторный механизм передачи сигнала в НСП. Требования к медиатору 19
3. Попытки экспериментального подтверждения кальций--медиаторной гипотезы Хагинса 20
4. Циклические нуклеотиды могут являться медиатором в передаче возбуждения в фоторецепторе 27
2. Функции гтф-связшащих белков 46
1. N-белки в механизмах гормональной рецепции 46
2. Участие ГТФ-связывающих белков в процессе элонгации трансляции прокариот 50
3. Участие ГТ$-связывающего белка в механизме активации светозависимой Щд в НСП 51
4. Постановка задачи исследования 57
Материалы и методы
1. Материалы 62
2. Получение препаратов наружных сегментов палочек сетчатки лягушки 63
3. Получение мембран дисков наружных сегментов (ЩЩС).. 65
4. Получение препарата,обогащенного водорастворимыми белками НСП 65
5. Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы, б5
6. Очистка комплекса белков НСП, обладающих светоза-висимой сорбцией на фоторецепторные мембраны 66
7. Термоденатурация препаратов и супернатанта НСП 66
8. Электрофоретическое разделение белков в полиакрил-амидном геле ( SDS -электрофорез) 67
9. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях 68
10. Разделение водорастворимых белков методом гель-фильтрации на Сефакриле S -200 70
11. Изоэлектрофокусирование белков в амфолинах 70
12. Связывание гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП.. 72
13. Измерение Са -связывающей способности фракций, полученных после гель-фильтрации белков супернатанта НСП 74
14. Тонкослойная хроматография нуклеотидов 74
15. Приготовление растворов с заданной концентрацией свободного Са х 74
16. Шосфорилирование /14о/ ГДІ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП 75
17. Определение аденилаткиназной активности 76
18. Измерение гуанозиндифосфактиназной КФ 2.7.4.6 активности 77
19. Методы измерения нуклеозидтрифосфатазных активностей. 77
20. Определение концентрации белка 78
Результаты собственных исследований 79
1. ГТФ-связывающий белковый комплекс НСП сетчатки лягушки 79
1. Зависимость связывания /^Н/ГВДФ препаратами НСП от количества обесцвеченного родопсина 79
2. SDS -электрофорез в ПААГе белков супернатанта НСП
3. Изоэлектрофокусирование белков супернатанта НСП 85
4. "Комплекс Кюна" из НСП сетчатки лягушки 85
5. Гель-фильтрация белков супернатанта и идентификация ГТФ-связывагащего белка 87
6. Термоинактивация ГТФ-связывающей способности супернатанта НСП 92
2. Обменный механизм формирования активного состояния трансдуцина НСП сетчатки лягушки 96
1. Кинетические характеристики процессов связывания /3Н/ПЩФ и /14С/ГДФ препаратами НСП 96
2. Характеристика процессов диссоциации комплексов гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП 100
3. Оценки констант диссоциации гуаниловых нуклеотидов с нуклеотидсвязывающими центрами НСП 102
3. Фосфорилирование ГДФ, связанного препаратами НСП сетчатки лягушки, как возможный механизм форми рования активного состояния трансдуцина 104
1. Фосфорилирование связанного ГДФ 105
2. Влияние АТФ на связывание ГДФ препаратами НСП 109
4. Фосфотрансферазные активности, катализируемые трансдуцином НСП сетчатки лягушки
1. Аденилаткиназная активность препаратов НСП 112
2. Аденилаткиназная активность водорастворимой фракции НСП 114
3. ГДФкиназная активность различных типов препаратов НСП и водорастворимой фракции НСП 123
4. Термоинактивация АК, ГДФкиназной активностей и ЩЦФ--связывающей способности препаратов супернатанта НСП. 125
5. Светозависимость ГДІкиназной активности 125
5. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП. 127
1. Гидролиз ГТІ при низких (менее I мкМ) концентрациях.. 128
2. Сопряженные ферментативные реакции в НСП 130
3. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП 131
4. Распределение ГТФазной активности во фракциях, полученных при гель-фильтрации белков супернатанта НСП 133
5. Термоинактивация НТФазных активностей 134
6. Модуляция ферментативных активностей трансдуцина ионами кальция. Возможная функциональная роль у субъединицы трансдуцина 138
1. Регуляция ионами кальция гидролиза , связанного ГТФ.. 138
2. Зависимость ГДФкиназной активности от концентрации ионов кальция 139
3. Модуляция нуклеозидтрифосфатазных активностей 142
4. Са -связывающая способность фракций, полученных при гель-фильтрации препарата супернатанта НСП 145
5. Термостабильность фактора, обеспечивающего Са регуляцию ГТФазной активности ш^ и Чд субъединиц трансдуцина 149
Обсуждение результатов 152
Виводы 174
