Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Основные принципы структурной организации лейкоцитарных рецепторов . 15
1.1.1. Структура ИГ-домена 18
1.1.2. Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных молекул на клеточной мембране 20
1.1.3. Гликозилирование лейкоцитарных рецепторов 23
1.1.4. Сигнальные мотивы в цитоплазматических районах лейкоцитарных рецепторов 25
1.2. Fc-рецепторы млекопитающих . 28
1.2.1. Семейство лейкоцитарных FcR человека и мыши . 29
1.2.2. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека 35
1.2.3. Активация и инактивация клеток FcR-комплексами человека 37
1.3. Семейство лейкоцитарных FcR-подобных молекул – FCRL
(CD307) 41
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Материалы и реактивы 50
2.2. Биологический материал . 53
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 53
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 53
2.3.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента – ЦТАБ 54
2.3.3. Удаление примесей бактериальной геномной ДНК из раствора плазмидной ДНК при помощи кислого фенола 54
2.4. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов. 55
2.4.1. Основные методы работы с рекомбинантной ДНК 55
2.4.2. Приготовление и трансформация химически компетентных клеток Е.coli 55
2.4.3. Приготовление и электропорация электрокомпетентных клеток Е. coli 56
2.5. Полимеразная цепная реакция и олигонуклеотиды 57
2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 60
2.7. Дот-гибридизация ДНК 60
2.7.1. Приготовление радиоактивно меченых зондов 60
2.7.2. Гибридизация мембран с радиоактивно мечеными зондами 61
2.8. Получение рекомбинантных конструкций 62
2.8.1. Создание рекомбинантных конструкций на основе pT7ZZ и pT7ABP векторов 62
2.8.2. Создание рекомбинантных конструкций на основе pET-21 вектора . 63
2.8.3. Создание рекомбинантных конструкций на основе pCI-neo вектора 65
2.8.4. Создание рекомбинантных конструкций на основе pAP-tag вектора . 66
2.9. Очистка рекомбинатных белков . 67
2.10. Иммунизация животных.. 69
2.10.1. Иммунизация кроликов 69
2.10.2. Иммунизация мышей ., 70
2.11. Иммуноферментный анализ 70
2.12. Иммуноблоттинг . 71
2.13. Получение моноклональных антител 72
2.14. Получение антипептидных антител 74
2.14.1. Получение конъюгата белок-пептид 74
2.14.2. Изготовление аффинного сорбента для очистки антител против FCRL1 74
2.14.3. Выделение антипептидных антител из антисыворотки кролика . 75
2.15. Транзитная трансфекция эукариотических клеток 75
2.16. Иммуноцитохимический анализ мазков клеток 76
2.17. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензий клеток 77
2.18. Иммуногистохимический анализ 77
2.19. Ферментативное дегликозилирование 78
2.20. Количественное измерение фосфатазной активности AP-содержащих белков 79
2.21. Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и е нормализация 79
2.22. Иммуноферментное окрашивание криосрезов миндалины человека и трансфицированных клеток при помощи AP-содержащих белков . 81
2.23. Метод скрининга антител к эпитопам нативных белков . 82
2.24. Компьютерный анализ последовательностей 83
Глава 3. Результаты и обсуждение . 84
3.1. Анализ экспрессии рецепторов человека - FCRL1, FCRL4 и FCRL6 84
3.1.1. FCRL1 84
3.1.1.1. Экспрессия FCRL1 в тканях человека . 84
3.1.1.2. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL1 . 92
3.1.1.3. Анализ экспрессии белка FCRL1 в клетках и тканях человека 99
3.1.2. FCRL4 105
3.1.2.1. Экспрессия FCRL4 в тканях человека 105
3.1.2.2. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL4 108
3.1.2.3. Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканяx человека 112
3.1.3. FCRL6 114
3.1.3.1. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL6 114
3.1.3.2. Анализ экспрессии белка FCRL6 в клетках и тканях человека 118
3.2. Поиск лигандов к FCRL1 и FCRL4 122
3.2.1. Получение молекулярных зондов на основе FCRL и плацентарной щелочной фосфатазы 124
3.2.2. Выявление связывающих FCRL1 и FCRL4 клеток в миндалине человека и экспрессионное клонирование потенциального лиганда FCRL4 127
3.3. Разработка метода скрининга антител к эпитопам нативных белков 133
Заключение 144
Выводы 147
Список литературы 149
