Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза 11
1.1.1. Краткая характеристика рака молочной железы 11
1.1.2. Значение метилирования ДНК в норме и при патологии 13
1.1.3. Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез 15
1.1.4. Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярньк маркеров канцерогенеза 17
1.1.4.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ 18
1.1.4.2. Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза 28
1.1.4.3. Аномальное метилирование ДНК в биологических жидкостях при РМЖ 29
1.2. Методы анализа метилирования ДНК 31
1.2.1. Методы исследования полногеномного метилирования 31
1.2.2. Ген-специфический анализ метилирования 33
1.2.2.1. Основные принципы ген-специфического анализа метилирования...33
1.2.2.2. Выбор метода ген-специфического анализа метилирования 36
1.2.3. Методы поиска дифференциально метилированных CpG-островков 38
1.2.3.1 .Метилчувствительное рестрикционно-ориентированное геномное сканирование 39
1.2.3.2. Метилчувствительный репрезентативно-дифференциальный анализ (МЧ-РДА) 41
1.2.3.3. Вычитательная гибридизация хромотографически изолированных пулов CpG-островков 43
1.2.3.4. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП) 44
1.2.3.5. Амплификация интерметилированных CpG-островков 46
1.2.3.6. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков
с использованием микрочиповых технологий 48
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Клинический материал 53
2.2. Забор крови и операционного материала 53
2.3. Выделение геномной ДНК 53
2.4. Выделение РНК 54
2.5. Модификация метода МЧФП 55
2.5.1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 55
2.5.2. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров 55
2.5.3. Электрофорез в ПААГ 57
2.5.4. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра 57
2.5.5. Амплификация фрагментов CpG-островков и определение нуклеотидной последовательности 57
2.6. Рестрикционный анализ 58
2. 7. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами 58
2. 8. Обработка ДНК бисульфитом натрия 59
2. 9. Метил-специфический сиквенс 61
2.10. Синтез кДНК 61
2.11. ОТ-ПЦР в реальном времени 62
2.12. Микросателлитный анализ 63
2. 13. Программное обеспечение 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Оптимизация метода поиска аномально метилированных CpG-островков 64
3.2. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ 66
3.3. Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных тканях человека 67
3.4. Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов в образцах опухолей РМЖ 68
3.4.1. Анализ метилирования и экспрессии гена BIN1 68
3.4.2. Анализ метилирования и экспрессии гена LAMC3 75
3.4.3. Анализ метилирования и экспрессии гена SEMA6B 80
3.4.4. Анализ генов, кодирующих субъединицы ионных каналов 84
3.4.5. Анализ метилирования и экспрессии гена VCIP135 87
3.4.6. Анализ метилирования и экспрессии гена PSMTF1 88
3.5. Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза 89
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы 96
