Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Малые нуклеиновые кислоты как регуляторы экспрессии генов ... 12
1.1.1 Антисмысловые олигонуклеотиды (Рациональный подход) 13
1.1.1.1 Влияние олигонуклеотидов основанное на конкуренции с нуклеиновыми кислотами 13
Подавление транскрипции 14
Подавление сплайсинга 14
Подавление трансляции 15
Изменение структуры РНК 15
1.1.1.2 Активация РНКазы Н 16
1.1.1.3 РНК - интерференция 16
1.1.2 Нуклеиновые аптамеры (Иррациональный подход) 18
1.1.3 Механизмы проникновения малых нуклеиновых кислот в клетки 18
1.1.3.1 Жидкофазный эндоцитоз 19
1.1.3.2 Рецептор-опосредованный эндоцитоз 19
1.1.4 Распределение олигонуклеотидов внутри клетки 21
1.2 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа... 23
1.2.1 Структура фермента 25
1.2.2 Участие GAPDH в слиянии клеточных мембран, взаимодействии с микротрубочками и везикулярном транспорте 27
1.2.3 Взаимодействие GAPDH с нуклеиновыми кислотами 39
1.2.3.1 GAPDH - ДНК/РНК-связывающий белок (физико-химические характеристики взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами) 39
1.2.3.2 Модификации и полимерные структуры GAPDH и их роль во взаимодействии фермента с нуклеиновыми кислотами 46
1.2.3.3 Сайт GAPDH, ответственный за связывание нуклеиновых кислот 4$
1.2.3.4 Влияние взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами на оксидоредуктазную активность фермента 51
1.2.3.5 Функциональная роль взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами 52
Транспортная функция 52
GAPDH - регулятор транскрипции 54
Защита нуклеиновых кислот от гидролиза 56
GAPDH - катализатор активности рибозимов 56
GAPDH и патогенез РНК-содержащих вирусов 57
Хеликазные свойства GAPDH 59
Участие GAPDH в поддержке структуры теломер 60
GAPDH и репарация ДНК 61
1.2.4 GAPDH и клеточный апоптоз. Взаимодействие с SiaHl протеазой 61
1.3 Заключение .62
2 Экспериментальная часть 65
2.1 Реактивы н материалы . ...65
2.1.1 Реактивы 65
2.1.2 Олигонуклеотиды 66
2.1.3 Ферменты 67
2.1.4 Клеточные линии, использовавшиеся в работе, и условия их культивирования 67
2.1.5 Буферы, среды и основные стоковые растворы 68
2.2 Методы 70
2.2.1 Электрофорез олигонуклеотидов, белков, ДНК 70
2.2.2 Определение концентрации белка 71
2.2.3 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов 72
2.2.4 Получение и очистка 32Р-меченных олигонуклеотидов 72
2.2.5 Синтез модифицированных олигонуклеотидов 72
2.2.6 Приготовление ядерного экстракта клеток HeLa 73
2.2.7 Определение молекулярной массы белков 74
2.2.8 Приготовление компетентных клеток Е. coli 74
2.2.9 Подготовка плазмиды pBlueScript Н(ТА) для прямого клонирования ПЦР продуктов 74
2.2.10 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 75
2.2.11 Активация ультрагеля А2 бромцианом 76
2.2.12 Приготовление слайдов и микроскопия 76
2.2.13 Получение клеточных фракций. Анализ распределения олигонуклеотид-связывающих белков по фракциям 77
2.2.14 Ступенчатое сульфат-аммонийное фракционирование белков ядерного экстракта 78
2.2.15 Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков 78
2.2.16 Выделение глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы из эритроцитов человека 79
2.2.17 Исследование стабильности олигонуклеотидного производного ClR-pN16 и ClR-p(N)t6 79
2.2.18 Определение величин констант диссоциации (Kj) олнгонуклеотид-белковых комплексов 80
2.2.19 Исследование влияния потенциальных конкурентов различной природы на взаимодействие глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы с олигонуклеотидами 81
2.2.20 Исследование влияния олигонуклеотидов на оксидоредуктазную активность глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы 81
2.2.21 Исследование олигонуклеотид-связывающего центра глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы 82
2.2.22 Определение урацил-ДНК-гликозилазной активности препарата GAPDH 82
2.2.23 ПЦР-сплайсинг гена gapdh человека 83
2.2.24 Клонирование и экспрессия гена gapdh человека в Е. coli 84
2.2.25 Выделение рекомбинантного препарата глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы
человека из клеток Е. coli 86
2.2.26 Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к GAPDH методом молекулярной селекции 87
2.2.27 Получение и характеризация поликлональных антител кролика против GAPDH 88
2.2.28 Выделение пула антител, специфически взаимодействующих с GAPDH 89
2.2.29 Иммунопреципитация комплекса GAPDH-олигонуклеотид антителами против GAPDH из ядерного экстракта клеток HeLa 90
3 Результаты и их обсуждение 91
3.1 Исследование олигонуклеотид-связывающего белка р38 клеток линии HeLa... 91
3.1.1 Модификация белков ядерного экстракта алкилирующими производными олигонуклеотидов различных последовательностей 92
3.1.2 Исследование внутриклеточного распределения р38 в клетках линий HeLa, А431 и HaCat 95
3.1.3 Определение константы диссоциации олигонуклеотид-белкового комплекса 98
3.2 Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающего белка ... 99
3.2.1 Выделение р38 из ядерного экстракта клеток линии HeLa 99
3.2.1.1 Ступенчатое сульфат-аммонийное фракционирование ядерного экстракта клеток
линии HeLa 100
3.2.1.2 Аффинная хроматография 102
3.2.2 Определение первичной структуры р38 102
3 .3 Исследование олигонуклеотид-связывающих свойств глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназы 104
3.3.1 GAPDH - клеточный белок р38, участвующий в селективной доставке олигонуклеотида
pN21 в ядра клеток 104
3.3.2 Изучение олигонуклеотид-связывающего центра GAPDH. Влияние взаимодействия
нуклеиновых кислот с GAPDH на ее" ферментативную активность 107
3.3.2.1 Изучение влияния потенциальных конкурентов различной природы на взаимодействие GAPDH с олигонуклеотидами 108
3.3.2.2 Влияние ДНК и РНК на ферментативную активность GAPDH 110
3.3.2.3 Локализация сайта, ответственного за связывание GAPDH с олигонуклеотидами, методом пептидного гидролиза 112
3.3.3 Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к GAPDH методом
молекулярной селекции 115
3.3.3.1 ПЦР-сплайсинг гена ga/к/й 115
3.3.3.2 Клонирование и экспрессия гена gapdh человека в Е. coli 117
3.3.3.3 Молекулярная селекция 119
3.3.3.4 Определение величины Ка комплекса GAPDH с олигонуклеотидом pN42 120
3.3.4 Сравнительное исследование распределения GAPDH и комплекса GAPDH-олигонуклеотид между ядром и цитоплазмой клеток линий А431, HeLa и HaCat 121
Выводы 126
Список литературы 127
