Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Общие требования к биомаркерам 11
2.2. Биомаркеры рака яичника, используемые в клинической диагностике 12
2.3. Разработка новых диагностических методов путем комбинирования биомаркеров 13
2.4. Применение транскриптомного подхода для поиска новых биомаркеров 15
2.5. Использование протеомных технологий для открытия новых биомаркеров 15
2.5.1. Двумерный электрофорез 16
2.5.2. Антительные микрочипы 20
2.5.3. Масс-спектрометрические методы. Технология белковых чипов SELDI-TOF 21
2.5.3.1 Общий подход к разработке диагностического алгоритма на основе масс-спектров 25
2.5.3.2 Результаты применения технологии SELDI-TOF для диагностики рака яичника 26
2.5.3.3 Подбор выборок для исследования 27
2.5.3.4 Природа маркерных масс-спектрометрических пиков 30
2.5.3.5 Биомаркеры, идентифицированные с использованием технологии SELDI-TOF 33
2.5.3.6 Сывороточный амилоид А острой фазы: возможная связь с раком 38
2.5.3.7 Анализ модификаций белков с использованием технологии SELDI-TOF 43
2.5.3.8 Перспективы использования технологии SELDI-TOF 45
3. Материалы и методы 47
3.1. Материалы 47
3.2. Объекты исследования 47
3.3. Иммуноферментный анализ 49
3.3.1 Измерение концентрации сывороточного амилоида А методом иммуноферментного анализа 49
3.3.2. Измерение концентрации СА125 методом иммуноферментного анализа 49
3.4. Профилирование сывороток с применением SELDI-TOF 50
3.4.1 Протокол пробоподготовки с использованием анионообменных чипов SAX2 50
3.4.2. Протокол пробоподготовки с использованием катионообменных чипов WCX 50
3.4.3. Протокол пробоподготовки с использованием обращеннофазовых чипов Н4 50
3.4.4. Протокол пробоподготовки с использованием нормальнофазовых чипов NP20 51
3.5. Анализ масс-спектров 51
3.6. Статистическая обработка результатов 51
3.6.1. Метод опорных векторов и рекурсивный отбор признаков 52
3.5.2. Логистическая регрессия и информационный критерий Акаике 52
3.5.3. Определение эффективности диагностического алгоритма 53
3.5.4. Метод пар с наибольшим счетом (top scoring pairs, TSP) 53
3.5.5. Вычисление коэффициента корреляции 53
3.5.6. Кластерный анализ 54
3.5.7. Программное обеспечение 54
4. Результаты и обсуждение 55
4.1. Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа 55
4.2. Масс-спектрометрическая детекция белка A-SAA в сыворотке крови 56
4.2.1. Определение чувствительности детекции A-SAA с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF. 57
4.2.2. Масс-спектрометрическое определение различных форм сывороточного амилоида в сыворотке 60
4.3. Обработка масс-спектров спектров SELDI-TOF, полученных с использованием чипов с нормальнофазовои поверхностью, с использованием жестких критериев для идентификации пиков 63
4.4. Классификация масс-спектров SELDI-TOF с использованием метода пар с наибольшим счетом (TSP) 63
4.5. Разработка диагностического алгоритма на основе комбинированных протеомных данных с использованием метода опорных векторов и логистической регрессии 64
4.6. Анализ результатов перекрестной проверки достоверности 66
4.7. Кластерный анализ данных масс-спектров SELDI-TOF 69
4.8. Дискриминаторные пики, отобранные различными классификаторами 79
5. Заключение 83
6. Выводы 85
7. Список литературы 86
