Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Молекулярные маркеры и их использование для исследования генома растений 8
1.2. ПДРФ-маркеры 11
1.3. Полимеразная цепная реакция 13
1.4. ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции 16
1.5. Использование RAPD-метода в исследовании генома растений 20
1.6. SCAR-маркеры и проблемы, связанные с их получением 30
1.7. Системы обнаружения известных точковых мутаций 39
1.8. Генетическая карта посевного гороха (Pisum sativum L.) 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Характеристика растительного материала 47
2.2. Получение гибридов Пи расщепляющихся популяций F2 47
2.3. Выделение тотальной ДНК из листьев гороха 53
2.4. Метод ПЦР с использованием коротких случайных праймеров (RAPD-метод) 54
2.5. Клонирование RAPD-фрагментов 56
2.5.1. Получение ДНК-фрагментов для клонирования 56
2.5.2. Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором 56
2.5.3. Приготовление компетентных клеток E.coli 57
2.5.4. Трансформация E.coli (штамм JM109) плазмидной ДНК 57
2.6. Метод выделения плазмидной ДНК 58
2.7. Анализ векторной ДНК на наличие требуемых вставок 59
2.8. Секвенирование клонированных фрагментов 59
2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей 59
2.10. Создание SCAR-маркеров 59
2.10.1. Подбор праймеров для амплификации специфических фрагментов ДНК 59
2.10.2.Реакция амплификации с использованием SCAR-праймеров 61
2.10.3.Подготовка ПЦР-фрагментов для рестрикции 62
2.10.4.Рестрикция ПЦР-фрагментов 62
2.11. Массовый сегрегационный анализ 62
2.12. Математическая обработка данных 63
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Картирование гена Ха-18 у гороха с помощью морфологических маркеров 65
3.2. Выявление RAPD-маркеров в ДНК гороха 66
3.3. Изучение наследования полиморфных RAPD-фрагментов 69
3.4. Количественная оценка RAPD-полиморфизма и построение дендрограмм. 71
3.5. Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха 75
3.6. Создание и изучение SCAR-маркеров 83
3.6.1. Получение SCAR-маркера из К10#950 RAPD-фрагмента 93
3.6.2. Получение SCAR-маркера из В474#800 RAPD-фрагмента 95
3.6.3. Получение SCAR-маркера из R03#1800 RAPD-фрагмента 97
3.6.4. Получение SCAR-маркера из Рг10#820 RAPD-фрагмента 99
3.6.5. Получение SCAR-маркера из К8#620 RAPD-фрагмента 101
3.6.6. Получение SCAR-маркера из Е16#860 RAPD-фрагмента 103
3.6.7. Получение SCAR-маркера из R06#470 RAPD-фрагмента 106
3.6.8. Получение SCAR-маркера из В474#550 RAPD-фрагмента 108
3.6.9. Получение SCAR-маркера из R11#540 RAPD-фрагмента 109
3.6.10.Получение SCAR-маркера из Рг10#660 RAPD-фрагмента 111
3.6.11.Получение SCAR-маркера из D6#550 RAPD-фрагмента 113
3.6.12.Получение SCAR-маркера из Рг10#340 RAPD-фрагмента 114
3.6.13.Получение SCAR-маркера из R06# 1100 RAPD-фрагмента 116
3.6.14.Получение SCAR-маркера из V03#800 RAPD-фрагмента 117
3.7 . Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров 129
Заключение 135
Выводы 141
Список литературы 142
