Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Каталитические характеристики и субстратная специфичность ОРН 9
1.2. Полигистидинсодержащие белки и носители для их иммобилизации
1.2.1. Полигистидинсодержащие белки 15
1.2.2. Полигистидинсодержащие производные органофосфатгидролазы 16
1.2.1. Носители для иммобилизации polyHis-содержащих белков 18
1.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованной ОРН и её производных 23
1.4. Фосфонаты и методы их деструкции
1.4.1. Химическая детоксификация ФОВ: проблема и методы её решения 37
1.4.2. Деструкция С-Р связи в фосфоновых кислотах и их производных
1.4.2.1. Щелочной и кислотный гидролиз 40
1.4.2.2. Деструкция С-Р связи в фосфонатах с использованием металлокомплексов 44
1.4.2.3. Окислительное разрушение С-Р связи в фосфонатах 44
1.4.2.4. Термическое разложение метилфосфоновой кислоты 46
1.4.2.5. Биодеструкция С-Р связи в фосфонатах 48
2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Реактивы 57
2.1.2. Используемые бактериальные штаммы 58
2.1.3. Питательные среды 58
2.1.4. Составы растворов 59
2.1.5. Приборы 59
2.2. Методы 59
2.2.1. Трансформация компетентных клеток 59
2.2.2. Биосинтез фермента His 12-ОРН 60
2.2.3. Биосинтез фермента His6-OPH 60
2.2.4. Получение носителей для металл-хелатирующсй хроматографии 61
2.2.5. Получение иммобилизованных препаратов органофосфатгидролазы, модифицированных полигистидиновыми последовательностями 61
2.2.6. Электрофоретический анализ белков в ПААГ 62
2.2.7. Определение концентрации белка
2.2.8. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой polyHis-аналогами ОРН в растворимой форме 63
2.2.9. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой polyHis-аналогами ОРН в иммобилизованной форме
2.2.10. Исследование температурного оптимума действия polyHis-аналогов ОРН в растворимой и иммобилизованной формах 65
2.2.11. Термоинактивация растворимых и иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.12. Изучение операционной стабильности биокатализагоров на основе иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.13. Получение и регидратация сухих иммобилизованных препаратов polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.14. Электронная микроскопия криоПААГ 66
2.2.15. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в растворимой форме 67
2.2.16. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в иммобилизованной форме в защитном материале 61
2.2.17. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в иммобилизованной форме в проточной системе 67
2.2.18. Определение концентрации фосфат-ионов 68
2.2.19. Определение концентраций МФК и муравьиной кислоты 69
2.2.20. Определение концентрации формальдегида 69
2.2.21. Определение концентрации метана 70
2.2.22. Определение концентрации метанола 70
2.2.23. Определение концентрации фосфонатов 71
2.2.24. Определение концентрации вещества типа Vx 72
3. Результаты и обсуждение 74
3.1. Белок Hisi2-OPH и его свойства в свободном и иммобилизованном состоянии 74
3.1.1. Биосинтез и иммобилизация белка Hisn-OPH 74
3.1.2. Влияние рН и температуры на каталитические характеристики Hisi2-OPH в растворимой форме 82
3.1.3. Каталитические характеристики His -OPH в растворимой форме 86
3.2. Свойства иммобилизованных биокатализаторов на основе His6-OPH и Hisi2-OPH..89
3.2.1. рН-зависимость активности иммобилизованных биокатализаторов 89
3.2.2. Влияние температуры на свойства иммобилизованных биокагализаіоров 3.2.3. Каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных субстратов 92
3.2.4. Стабильность иммобилизованных биокатализаторов при хранении и периодическом использовании 102
3.2.5. Получение сухих форм иммобилизованных биокатализаторов 105
3.2.6. Исследование возможности масштабирования объёма иммобилизованного биокатализатора 106
3.3. Применение растворимой и иммобилизованной форм Нівб-ОРН в процессе гидролиза фосфонатов 111
3.3.1. Растворимая форма His6-OPH в реакциях гидролиза фосфонатов 111
3.3.1.1. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под действием His6-OPH Ill
3.3.1.2. Каталитические характеристики гидролиза МФК под действием Нівб-ОРН 113
3.3.1.3. Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 115
3.3.1.4. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 125
3.3.1.5. Ферментативный гидролиз ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 126
3.3.1.6. Механизм реакции гидролиза МФК под действием His6-OPH 128
3.3.2. Иммобилизованная His6-OPH в реакциях разложения фосфонатов 132
3.3.2.1. Иммобилизованная His6-OPH в составе защитного материала 132
3.3.2.2. Разложение фосфонатов в проточных системах под действием иммобилизованных биокатализаторов 135
Выводы 138
Список литературы
