Введение
2. Обзор литературы
2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические характеристики фотосенсибилизаторов 9
2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы 11
2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG
2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG 13
2.3.2. Кофактор MiniSOG - производное рибофлавина 14
2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG 17
2.4. Механизм клеточной гибели при воздействии ФС на клетки 19
2.4.1. Апоптоз 20
2.4.1.1. Основные пути внутренней передачи сигнала в ответ на ФДТ 21
2.4.1.2. ФДТ-индуцируемый внутренний путь гибели клеток, независимый от каспаз...
2.4.2. Аутофагия 27
2.4.3. Некроз
2.5. Механизмы клеточной защиты 31
2.6. Нацеливание фотосенсибилизаторов на рецептор HER2/neu 32
2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры 3. Материалы и методы 44
4. Результаты и обсуждение 58
4.1. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств 58
4.1.1. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG 58
4.1.2 Характеристика функциональных свойств 4D5scFv-miniSOG 60
4.1.2.1 Связывание с рецептором HER2/neu - иммунохимический метод
4.1.2.2 Спектральные свойства 4D5scFv-miniSOG 61
4.1.2.3 Специфичность связывания с HER2/neu на клетках 61
4.1.2.4 Конкурентное ингибирование 62
4.1.2.5 Внутриклеточная локализация 4D5scFv-miniSOG 63
4.2. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облучении синим светом 66
4.2.1 Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG in vitro 66
4.2.2 Сочетанное действие 4D5scFv-miniSOG и таксола 67
4.2.3 Выяснение механизмов гибели клетки под воздействием 4D5scFv-miniSOG
4.2.3.1 Микроскопия 69
4.2.3.2 Активность каспазы-3 70
4.2.3.3 Фрагментация ДНК 70
4.3. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров 72
4.3.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ:4Б58сРу-тіпі8СЮ,
возбуждаемых ближним ИК-светом 73
4.3.1.1 Перекрывание спектров 73
4.3.1.2 Стабилизация НАФ в водных растворах 74
4.3.1.3 FRET 75
4.3.1.4 Фёрстеровский радиус 76
4.3.1.5 Доказательство FRET 76
4.3.1.6 Конъюгация НАФ с белками 78
4.3.2. Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом 79
4.3.2. 1 Получение и характеристика адресного белка DARPin-mCherry 79
4.3.2.2 Получение и характеристика связывания с клетками конъюгатов НАФ-PMAO:DARPin-mCherry 83
4.3.2.3 Оценка цитотоксичности конъюгата НАФ(ТтЗ+)РМАО:БАІІРігі-ггіСгіеггу при облучении ближним ИК-светом 84
4.3.3. Оценка использования рибофлавина в качестве ФС 91
4.3.3.1. Изучение способности рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых
клетках 91
A33.2. Изучение онкоспецифической цитотоксичности рибофлавина при облучении УФА1 92
Выводы: 94
Заключение 95
Список сокращений и условных обозначений 96
Список литературы
