Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Гибридомная технология 11
1.2. Свойства, определившие широкое применение МА 14
1.3. Лекарственные препараты на основе МА 16
1.3.1. Гуманизация МА 16
1.3.2. Примеры терапевтических МА 18
1.3.3. Иммунотоксины 20
1.4. Использование МА в диагностике 21
1.4.1. Принцип ИФА 22
1.4.2. Форматы ИФА 23
1.4.3. Иммунохроматографический анализ 25
1.5. МА как инструмент исследования в фундаментальной науке 26
1.5.1. МА для очистки молекул и протеомики 26
1.5.2. МА в вирусологии 28
1.5.3. МА в биохимии рецепции 29
1.5.4. МА в изучении иммунной системы 31
1.5.5. МА в энзимологии 32
1.6. Характеристика сериновых эндопептидаз AlpA И AlpB, секретируемых Lysobacter sp. XL1 34
1.6.1. Бактерия Lysobacter sp. XL1 34
1.6.2. Сериновые эндопептидазы AlpA и AlpB 38
1.6.3. Лизоамидаза 42
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ 44
2.2. Иммунизация мышей линии Balb/C пропептидами и зрелыми формами эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp.XL1 44
2.3. Иммунизация мышей линии Balb/C пептидами из эндопептидазы AlpB Lysobacter sp.XL1 46
2.3.1. Конъюгирование пептидов с KLH 46
2.3.2. Иммунизация конъюгатами пептидов с KLH 46
2.4. Получение МА против пропептидов и зрелых форм эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp.XL1 47
2.4.1. Приготовление фидерного слоя макрофагов мыши 47
2.4.2. Культивирование клеток мышиной миеломы SP2/0 48
2.4.3. Замораживание клеток 48
2.4.4. Получение иммунных спленоцитов мыши 49
2.4.5. Гибридизация клеток миеломы и лимфоцитов 49
2.4.6. Культивирование первичных гибридом в среде ГАТ 50
2.4.7. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений 50
2.4.8. Наработка МА в асцитной жидкости мышей линии Balb/C 51
2.4.9. Определение типов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов 51
2.4.10. Очистка МА из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на белок А-агарозе 51
2.4.11. Определение концентрации белков 52
2.4.12. Определение Кафф иммуноглобулинов 52
2.5. Получение поликлональных антител против денатурированной формы эндопептидазы AlpA 53
2.6. «Сэндвич»–ИФА на основе МА к пропептидам и зрелым формам эндопептидаз AlpA и AlpB 53
2.6.1. Конъюгирование антител с биотином 53
2.6.2. «Сэндвич»–ИФА 54
2.7. Электрофорез 55
2.8. Иммуноблоттинг 55
2.9. Получение клеточных фракций Lysobacter sр. XL1 55
2.10. Определение литической активности 56
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Получение стабильных гибридомных клонов–продуцентов МА к пропептидам и зрелым формам эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 57
3.1.1. Получение и характеристика МА к ProA и ProB 57
3.1.1.1. Получение МА к пропептидам 57
3.1.1.2. Иммунохимическая характеристика МА к пропептидам 59
3.1.2. Получение и характеристика МА к зрелым формам эндопептидаз AlpA и AlpB 64
3.1.2.1. Получение МА к зрелой форме AlpA 64
3.1.2.2. Получение МА к зрелой форме AlpB 65
3.1.2.3. Иммунохимическая характеристика МА к зрелым формам 68
3.2. Разработка методов количественного определения пропептидов и зрелых форм эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 на основе полученных МА 71
3.2.1. Разработка тест–систем для количественного определения ProA, ProB и зрелой формы эндопептидазы AlpA 73
3.2.2. Разработка тест–системы для количественного определения зрелой формы эндопептидазы AlpB 79
3.3. Количественная оценка «сэндвич»–ИФА ProA, ProB и зрелых форм AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в многокомпонентных препаратах 81
3.3.1. Определение в культуральных жидкостях 81
3.3.2. Определение в клеточных фракциях 83
3.4. Определение молекулярных форм AlpА и AlpB в клеточных фракциях Lysobacter sp. XL1 методом иммуноблиттинга 85
3.5. Определение AlpA и AlpB в лизоамидазе 89
Заключение 90
Выводы 91
Список используемой литературы 92
Список работ, опубликованных по теме диссертации 119
Благодарности 121
