Введение
2. Обзор литературы. Импорт макромолекул в митохондрии 10
2.1. Импорт белков в митохондрии 10
2.1.1. Сигнальные последовательности импортируемых белков 13
2.1.2. Претранслокациоішое разворачивание предшественников митохондриаль-ных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности 15
2.1.3. Транслокационный комплекс внешней митохондриальной мембраны (ТОМ) 16
2.1.4. Встраивание белков во внешнюю мембрану митохондрий при помощи SAM-комплекса 19
2.1.5. Импорт белков в межмембранное пространство митохондрий 20
2.1.6. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ23 и мотор транслокации 21
2.1.7. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ22 и малые Tim-белки межмембранного пространства 26
2.1.8. Экспорт белков из митохондриального матрикса 28
2.2. Импорт РНК в митохондрии 28
2.2.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших 31
2.2.2. Импорт тРНК в митохондрии растений 36
2.2.3. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей 37
2.2.4. Импорт РНК в митохондрии млекопитающих 41
2.3. Импорт ДНК в митохондрии 43
3. Материалы и методы исследования 44
3.1. Материалы 44
3.1.1. Реактивы 44
3.1.2. Коммерческие наборы 45
3.1.3. Антитела 46
3.1.4. Приборы и оборудование 46
3.1.5. Штаммы микроорганизмов 46
3.1.6. Питательные среды 47
3.1.7. Генно-инженерные конструкции 48
3.1.8. Олигонуклеотиды 52
3.2. Методы 54
3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 54
3.2.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфо-рилирование 54
3.2.3. Лигирование 54
3.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера 55
3.2.5. Трансформация клеток E.coli 55
3.2.6. Трансформация клеток Saccharomyces cerevisiae 56
3.2.7. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae 57
3.2.8. Измерение поглощения кислорода клетками 57
3.2.9. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток 57
3.2.10. Выделение ДНК из клеток дрожжей 58
3.2.11. Выделение митохондрий из клеток дрожжей 58
3.2.12. Выделение дрожжевых митохондриальных РНК 59
3.2.13. Выделение суммарных дрожжевых тРНК в аминоацилированном состоянии 59
3.2.14. Нозерн-блот гибридизация 60
3.2.15. In vitro Т7-транскрипция 60
3.2.16. Радиоактивное мечениетРНК 61
3.2.17. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E.coli 62
3.2.18. Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии на колонках с никель-агарозой 62
3.2.19. Вестерн-блот гибридизация 63
3.2.20. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 63
3.2.21. Транспорт радиоактивно меченных тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 64
3.2.22. Митохондриальная трансляция in vivo 65
3.2.23. Метод задержки в геле 65
3.2.24. Футпринтинг 65
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Образование РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии дрожжей 67
4.2. Изучение структуры РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга 74
4.3. Поиск участков preMsklp, необходимых для направления импорта тРНК в митохондрии 84
4.4. Создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 не импортировалась бы в митохондрии, и изучение фенотипического эффекта такого дефекта 99
Выводы 114
Благодарности 115
Список цитируемой литературы 116
Приложение 132
