Введение
1. Ингибиторы интегразы вируса иммунодефицита человека и механизм их действия/обзор литературы/ 8
1.1. Интеграза ВИЧ-1: строение и функции 10
1.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 15
1.2.1. Низкомолекулярные ингибиторы 15
1.2.1.1. Производные дикетокислот 15
1.2.1.2. Производные нафтиридина 23
1.2.1.3. Стирилхинолиновые ингибиторы 26
1.2.1.4. L-цикориевая кислота и ее производные 33
1.2.1.5. Производные гидроксикумарина 37
1.2.2. Пептиды и антитела 40
1.2.3. Олигонуклеотиды 48
2. Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами /результаты и обсуждение/ 52
2.1. Оптимизация структуры олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 55
2.1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 55
2.1.1.1. Дизайн и синтез конъюгатов 55
2.1.1.2. Влияние структуры ненуклеотидной части конъюгата на его ингибирующую активность 58
2.1.1.3. Влияние положения ненуклеотидной части в структуре конъюгата на его
ингибирующую активность 62
2.1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части ингибитора интегразы ВИЧ-1 63
2.1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата 63
2.1.2.2. Влияние модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его конъюгатов 64
2.1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК-связывающих ферментов 67
2.1.4. Проверка ингибирующей активности конъюгатов 2-0-метил-олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой 71
2.2. Механизм действия олигонуклеотидных конъюгатов. Определение участка связывания ингибитора 74
2.2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК 74
2.2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания 76
2.2.2.1. Дизайн и синтез олигонуклеотидных ингибиторов, содержащих 2,3-ДИгидроксипропильную группировку при 2-0-атоме уридина 78
2.2.2.2. Оптимизация условий ковалентного присоединения ингибитора к интегразе 79
2.2.2.3. Получение препаративного количества ковалентно связанного комплекса ингибитора T2-F1 с интегразой, его триптический гидролиз и подготовка продуктов гидролиза к масс-спектрометрическому анализу 83
2.2.2.4. Масс-спектрометрический анализ продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса ингибитора с интегразой 86
2.3. Доставка олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 в клетки 93
2.3.1. Оптимизация условий формирования комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями 94
2.3.2. Проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки 97
2.3.2.1. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями 97
2.3.2.2. Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA 102
Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках 104
3. Экспериментальная часть 107
3.1. Реактивы иматериалы
3.1.1. Реактивы 107
3.1.2. Ферменты 107
3.1.3. Олигонуклеотиды 108
3.1.4. Буферные растворы 109
3.2. Методы 109
3.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином 112
3.2.2. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 113
3.2.3. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность фрагмента Кленова 115
3.2.4. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность эндонуклеазы рестрикции Msp 9RI 116
3.2.5. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность мутантов интегразы ВИЧ-1 117
3.2.6. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ПВЧ 117
3.2.7. Изучение действия олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК 118
3.2.8. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания 118
3.2.9. Изучение проникновения олигонуклеотидного конъюгата в клетки 122
Приложение 125
Выводы 132
Литература
