Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы 11
2.1. Инсуляторы 11
2.1.1. СTCF – многофункциональный фактор 12
2.1.2. Картирование сайтов связывания инсуляторных белков позвоночных 14
2.1.3. CTCF и белки когезинового комплекса 15
2.1.4. 5 -cHS4 инсулятор из бета-глобинового локуса кур 17
2.1.5. Механизмы функционирования инсуляторов 19
2.1.6. Функциональные методы изучения инсуляторов 22
2.2. Энхансеры 23
2.2.1. Структура энхансеров 24
2.2.2. Функциональные модели активации транскрипции энхансерами 29
2.2.3. Механизмы действия энхансеров 30
2.2.4. Регуляция активности энхансеров 33
2.2.5. Идентификация и функциональный анализ энхансеров 36
3. Материалы и методы 42
3.1. Материалы 42
3.2. Методы
3.2.1. Стандартные методики. 51
3.2.2. ПЦР-амплификация фрагментов ДНК. 51
3.2.3. Трансформация клеток E. coli. 53
3.2.4. 5 -RACE 54
3.2.5. Подготовка плазмид для секвенирования 55
3.2.6. Электрофорез в агарозном геле 55
3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (очистка меченой ДНК) 55
3.2.8. Связывание меченых фрагментов ДНК с белками in vitro 56
3.2.9. Сдвиг электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (EMSA) 56
3.2.10. Использованные культуры клеток 57
3.2.11. Трансфекция клеток с использованием реагента Lipofectamine 2000 58
3.2.12. Получение клеточного лизата и измерение активности люциферазы 59
3.2.13. 3С анализ 59
3.2.14. Определение количества трансфицированных плазмид в ядрах 62
4. Результаты и их обсуждение 63
4.1. Функциональная диссекция энхансерного элемента, расположенного во втором интроне гена u2af1l4 человека 63
4.1.1. Анализ активности фрагментов энхансера 12 64
4.1.2. Анализ функциональной консервативности энхансера 12 67
4.2. Изучение двунаправленного промотора генов psenen и U2AF1L4 4.2.1. Точки инициации транскрипции и тканевая специфичность транскрипции генов PSENEN и U2AF1L4 73
4.2.2. Анализ активности промоторной области генов PSENEN и U2AF1L4 76
4.2.3. Функциональный анализ консервативных областей промотора генов PSENEN и U2AF1L4 79
4.3. Оценка энхансер-блокирующей активности инсуляторов картированных в локусе fxyd5-cox7a1 хромосомы 19 человека 84
4.3.1. Конструирование плазмид 84
4.3.2. Выбор фрагментов ДНК 85
4.3.3. Энхансерная активность геномных фрагментов 89
4.3.4. Энхансер-блокирующая активность инсулятора сHS4 из бета-глобинового локуса кур 90
4.3.5. Энхансер-блокирующая активность геномных фрагментов 92
4.3.6. Энхансер-блокирующая активность фрагментов, отобранных при помощи негативно-позитивной селекции 94
4.4. Активация промотора энхансером в транс положении 96
4.4.1. Конструирование плазмид 96
4.4.2. Активация промотора энхансером в транс 98
4.4.3. Промоторная и клеточная специфичность 99
4.4.4. Взаимодействие промотора с энхансером 1 5.
Заключение и выводы 105
6. Список цитированной литературы 106
