Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1.1. Клинические и гистопатологические признаки Болезни Альцгеймера 11
1.1.2. Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера 13
1.2. Функции генов пресенилшюв , 19
1.2.1.1. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении АРР 20
1.2.1.2. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении Notch 24
1.2.1.3. Другие субстраты внутримембрапного протеолюа пресенилина 30
1.2.2. Обнаружение компонентов -у-секретазного комплекса 34
1.2.3. Участие пресенилинов в аполтозе , , „38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Программы биоинформатики 40
2.2. Векторы, использованные для клонирования 41
2.3. Набор методов для получения рекомбинантных конструкций 42
2.3.1. Эндонуклеазное расщепление ДНК , 42
2.3.2. Переосаждение ДНК 42
2.3.3. Электрофоретическое разделение ДНК фрагментов 42
2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. 42
2.3.5. Лигирование фрагментов ДНК 43
2.3.6. Культивирование клеток Е. coli 43
2.3.7. Транформация клеток Е. coli 43
2.3.8. Отбор клонов, содержащих плазмидные конструкции 43
2.3.9. Секвенирование 44
2.4. Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов (ОТ-ПЦР) 44
2.4.1. Вьщеление геномной ДНК из периферической венозной крови человека , 44
2.4.2. Вьщеление тотальной РНК из периферической венозной крови человека 44
2.4.3. Выделение мРНК 45
2.4.3. Получение кДНК 45
2.4.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 45
2.5. Частные методы, использованные при клонировании, изучении экспрессии генов на уровне транскрипции,., 46
2.5.1. Получение конструкции для наработки N-концевого фрагмента белка hPSl в клеткахE.coli 46
2.5.2. Получение конструкций для экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в культурах клеток млекопитающих 46
2.5.3. Изучение экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в клетках крови человека 47
2.5.4. Исследование экспрессии IMPAS генов человека . 50
2.5.4.1. Анализ экспрессии ЫМР1 гена в различных тканях и органах человека 50
2.5.4.2. Исследование альтернативных транскриптов гена ЫМР1 50
2.5.4.3. Получение и клонирование полноразмерных копий альтернативных форм сплайсинга гена hIMPI 51
2.5.4.4. Получение и клонирование мутантных форм гена hJMPl 55
2.5.4.5. Клонирование делеционных и мутантных форм гена hPSl 56
2.6. Набор методов для получения и исследования трансфицированных культур клеток млекопитающих 57
2.6.1. Культивирование клеток млекопитающих 57
2.6.2. Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих 58
2.6.3. Трансфекпия культур клеток РС12 с помощью электропорации 58
2.6.4. Траисфекция культур клеток НЕК293 с использованием набора
LipofectAMINE PLUS 58
2.6.5. Получение трансфицированных поликлональных культур клеток РС12 и клонов индивидуального происхождения 58
2.6.6. Выделение высокополимериой геномной ДНК клеточных культур 59
2.6.7. Анализ стабильно-трансфицировапных культур PC 12 с помощью полимеразной цепной рсавдии (ПЦР) 59
2.6.8. Хранение полученных клеточных линии 60
2.6.9. Изучение дифференцировки РС12 клеток.. . 60
2.6.10. Анализ пролиферации клеток РС12 , 60
2.6.11. Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток РС12 61
2.6.12. Выделение белковых гомогенатов из культур клеток PC 12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг 61
2.6.13. Получение белковых лизатов культур клеток НЕК293. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг ,... 62
2.6.14. Получение антител, использованных в работе 62
2.6.15. Изучение гликозилирования белков , 63
2.7. Материалы и методы исследования на модели дрожжей Saccharomyces cerevisiae 64
2.8. Материалы и методы исследования иа модели нематоды Caenorhabditis elegans 64
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Создание набора плазмидных конструкций, трансфицированных культур клеток млекопитающих, трансгенных линий Drosophila melanogaster , ,. 66
3.1.1. Создание набора плазмидных конструкций 66
3.1.1.1. Плазмидпые конструкции для экспрессии в культуре клеток млекопитающих , 66
3.1.1.2. Плазмидные конструкции для экспрессии генов в трансгенных Drosophila melanogaster 69
3.1.1.3. Плазмидные конструкции для наработки белка в Escherichia coli 71
3.1.1.4. Плазмидные конструкции для дцРНКи в Caenorhabditis elegans 72
3.1.2. Создание набора стабильно трансфицированных культур клеток млекопитающих 73
3.1.3. Получение и анализ трансгенных линий Drosophila melanogaster 74
3.2.1. Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур 75
3.2.2. Апоптоз и мутантные пресенилины в поликлоиальных клеточных культурах 77
3.2.3. Мутации и высокий уровень непроцессированной формы hPSl замедляют пролиферативную активность и повышают чувствительность к апоптозу моноклональных PC 12 культур , 83
3.3. Изучение альтернативных транскриптов гена. PSJ человека 90
3.4.1. Обнаружение новых семейств белков, имеющих сходство с пресенилинами 93
3.4.2. РА-домен 99
3.4.3. Ш/М-гены и IMPAS-белки человека 102
3.4.4. Изучение экспрессии ММР1 гена в тканях и органах человека. Исследование альтернативных транскриптов гена hlMPl 105
3.4.5. Изучение экспрессии белка ЫМР1 в клетках млекопитающих. 108
3.4.6. Участие ЫМР1 в протеолитическом расщеплении полноразмерного белка hPSl Ill
3.4.7. IMPAS не является критическим фактором индукции UPR (Unfolded-Protein Response) в Saccharomyces cerevisiae , 114
3.4.8. Ингибирование гена-ортолога hlMPl у нематоды Caenorhabditis elegans
(Ce-imp-2) 116
Заключение 118
Выводы 121
Список литературы 123
