Оглавление
1. ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................ 5
Актуальность и степень разработанности темы ......................................................... 5
Цель и задачи .................................................................................................................. 7
Научная новизна и практическая значимость............................................................. 8
Методология и методы исследования ......................................................................... 9
Положения, выносимые на защиту .............................................................................. 9
Личный вклад автора ................................................................................................... 10
Публикации и апробация работы ............................................................................... 11
Структура и объем диссертации ................................................................................. 11
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................................... 12
Использование дрожжей для рекомбинантной продукции белков........................ 12
Генотипическое и фенотипическое разнообразие дрожжей Komagataella........... 13
Особенности и преимущества использования Komagataella phaffii в качестве
платформы для синтеза рекомбинантных белков .............................................................. 14
Применение Komagataella phaffii для рекомбинантной экспрессии ..................... 16
2.4.1. Ферментные препараты ........................................................................................ 16
2.4.2. Вакцины .................................................................................................................. 17
2.4.3. Небелковые молекулы .......................................................................................... 18
2.4.4. Применение K. phaffii в качестве дрожжей второго поколения ...................... 19
Метаболизм метанола и сорбитола у K. phaffii......................................................... 20
2.5.1. Метаболизм метанола ........................................................................................... 21
2.5.2. Метаболизм сорбитола ......................................................................................... 23
Генетическая инженерия K. phaffii ............................................................................. 26
2.6.1. Промоторы и терминаторы .................................................................................. 26
Регулируемая экспрессия .............................................................................. 27
Конститутивная экспрессия .......................................................................... 29
2.6.2. Терминаторы .......................................................................................................... 30
2.6.3. Сигнальные последовательности ........................................................................ 30
2.6.4. Селективные маркеры и копийность .................................................................. 32
Ферментация продуцентов K. phaffii ......................................................................... 34
2.7.1. Методы ферментации с использованием дополнительных источников
углерода ................................................................................................................................ 35
2.7.2. Применение сорбитола при PAOX1-зависимой экспрессии генов ..................... 35
3
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................... 37
Штаммы ......................................................................................................................... 37
Микробиологические среды ....................................................................................... 38
Культуральные методы работы с микроорганизмами ............................................. 39
3.3.1. Методы работы с E. coli ........................................................................................ 39
3.3.2. Подготовка компетентных клеток K. kurtzmanii Y-727 .................................... 40
3.3.3. Трансформация и селекция K. kurtzmanii Y-727 ............................................... 40
3.3.4. Индукция метанолом трансформантов с PAOX1-зависимой рекомбинантной
экспрессией .......................................................................................................................... 41
3.3.5. Индукция смесью сорбитол/метанол в пробирках ............................................ 41
3.3.6. Ферментация продуцентов в биореакторе ......................................................... 41
Методы работы с ДНК и конструирование плазмид ............................................... 42
3.4.1. Наработка и выделение плазмидной ДНК в клетках E. coli ............................ 42
3.4.2. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей .......................................... 43
3.4.3. ПЦР, рестрикция, лигирование и электрофорез ДНК ...................................... 43
3.4.4. Конструирование плазмид ................................................................................... 44
Аналитические и биохимические методы ................................................................. 49
3.5.1. Электрофорез белков в ПААГ ............................................................................. 49
3.5.2. Очистка и определение концентрации рекомбинантных белков .................... 50
3.5.3. Оценка уровня экспрессии lacZ ........................................................................... 50
3.5.4. Определение кинетических параметров сорбитолдегидрогеназ ..................... 51
3.5.5. Определение концентрации сорбитола в культуральной жидкости ............... 52
3.5.6. Оценка максимальной удельной скорости роста дрожжей Komagataella ..... 52
3.5.7. Измерение активности эндогликозидазы (Egh12) Thielavia terrestris в
культуральной жидкости .................................................................................................... 52
Программное обеспечение, базы данных и статистика ........................................... 53
3.6.1. Базы данных и электронные интернет-ресурсы ................................................ 53
3.6.2. Программы ............................................................................................................. 54
3.6.3. Статистическая обработка данных ...................................................................... 54
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................... 55
Комплементационный анализ и исследование метаболизма сорбитола у
K. kurtzmanii ............................................................................................................................. 55
4.1.1. Секвенирование генома дрожжей K. kurtzmanii ВКПМ Y-727........................ 55
4.1.2. Поиск генов, способных участвовать в метаболизме сорбитола у K. phaffii и
их ортологов в геноме K. kurtzmanii ................................................................................. 58
4
4.1.3. Комплементационный анализ .............................................................................. 62
4.1.4. Анализ штаммов K. kurtzmanii с нокаутом SDH727.......................................... 65
4.1.5. Сравнительная характеристика ферментов Sdh115 и Sdh727 ......................... 68
Получение препаратов ................................................................................... 68
Стабильность ферментных препаратов Sdh115 и Sdh727, очищенных
методом Ni-NTA .............................................................................................................. 69
Определение физико-химических параметров Sdh115 и Sdh727 ............. 70
4.1.6. Оценка экспрессии SDH115 и SDH727 ............................................................... 73
Сравнительная оценка экспрессии lacZ в окружении регуляторных
элементов генов SDH115 и SDH727 .............................................................................. 73
Оценка активности промоторов PSDH115 и PSDH727 ....................................... 75
Влияние терминаторов TSDH115 и TSDH727 на экспрессию ............................ 76
4.1.7. Дополнительная экспрессия SDH727 также приводит к повышению
интенсивности метаболизма сорбитола у K. kurtzmanii ................................................. 78
4.1.8. Влияние клеточного окружения на экспрессию SDH115 ................................. 79
4.1.9. Активность PSDH в сравнении с PAOX1 и PGAP ...................................................... 82
Оценка влияния скорости метаболизма сорбитола на рекомбинантную
продукцию клетками K. kurtzmanii ....................................................................................... 83
4.2.1. Получение штаммов-продуцентов K. kurtzmanii с улучшенным усвоением
сорбитола .............................................................................................................................. 83
4.2.2. Влияние соотношения метанола и сорбитола на синтез целевых белков ...... 87
4.2.3. Влияние концентрации сорбитола в среде на эффективность индукции
метанолом............................................................................................................................. 91
4.2.4. Индукция смесью сорбитол/метанол штамма Y_Egh1202 в биореакторе ...... 95
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................... 98
6. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ ........................................................................................................... 100
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................ 102
