Введение
РАЗДЕЛ 1. Природные а-конотоксины и их синтетические аналоги в исследовании никотиновых ацетил-холиновых рецепторов. (Литературный обзор).
Глава 1. Химическое строение, пространственная организация и специфичность действия а-конотоксинов 15
Глава 2. Области взаимодействия а-конотоксинов и нАХР
12 1 Синтетические аналоги а-конотоксинов 20
1 2 2 Мутации в нАХР и парные мутации в а-конотоксинах и нАХР 24
1.2 3 Модели комплексов а-конотоксинов с нАХР, построенные на основе пространственной структуры ацетилхолин-связывающего белка 24
РАЗДЕЛ 2. Исследование лиганд-связывающих участков рецепторов нейротрансмиттеров с помощью природных и химически модифицированных нейропептидов и нейротоксинов. (Результагы работы и их обсуждение).
Глава 1. Получение биотинилированных и фотоактивируемых аналогов вещества Р и изучение их взаимодействия с нейрокининовыми и никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами ..29
2.1 1 Метод обнаружения рецептора вещества Р на основе биотин-стрептавидиновой системы 29
2 1 2 Исследование взаимодействия рецептора вещества Р с антителами к его синтетическим фрагментам и к веществу Р .32
2 1 3 Тестирование рецептора вещества Р с использованием радиоактивной формы его низкомолекулярного антагониста 34
2 1 4 Анализ взаимодействия рецептора вещества Р с токсическими компонентами ядов змей. 36
2 1 5 Получение и характеристика фотоактивируемых производных вещества Р с метками в iV-концевой части молекулы 37
2 1 6 Заключение. 40
Глава 2 Синтез новых фотоактивируемых производных а-неиротоксинов из ядов кобр 41
22 1 Получение и характеристикабензофеноновых производных ШII 41
2 2 2 Изучение зависимости параметров мечения нАХР Т cahfornica фотопроиз водными нейротоксина от химической природы введенной фотогруппы 44
2 2 3 Заключение 46
Глава 3 Получение природных и модифицированных а-конотоксинов и изучение их связывания с нАХР Т cahfornica . 49
2 3 1 Твердофазный пептидный синтез а-конотоксинов 49
23 2 Получение и характеристика радиоактивных производных а-конотоксинов 51
2 3 3 Получение фотоактивируемых аналогов а-конотоксинов GI и Ml и их взаимодействие с нАХР Т cahfornica 55
2 3 4 Локализация фрагментов нАХР Т cahfornica, взаимодействующих с радиоактивным фотоактивируемым аналогом а-конотоксина GI 74
2 3 5 Изучение влияния заряженных аминокислотных остатков в а-конотоксинах мышечного типа на сродство к нАХР Т cahfornica . ... 83
Глава 4 Синтез природных и модифицированных а-конотоксинов, взаимодействующих с нейрональными а7 нинотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами 89
2 4 1 Получение гетерологически экспрессированных в Е coh внеклеточных доменов а7 нАХР крысы и характеристика их физико-химических и связывающих свойств 92
2 4 2 Оценка роли отдельных элементов а-конотоксинов GI и Iml, определяющих их специфичность . 97
2 4 3 Синтез аналогов а-конотоксина PnIA и характеристика их действия на
полноразмерных а7 холинорецептора 100
Глава 5 Взаимодействие а-конотоксинов с ацетилхолин-связывающими белками. 103 Глава 6 Рентгеноструктурный анализ комплекса а-конотоксина [A10L,D14K]PnIA с АХСБ A cahformca с разрешением 2 4 А . „108
Глава 7 Моделирование пространственных структур комплексов а конотоксинов и а-нейротоксинов с различными типами холинорецепторов 111
РАЗДЕЛ 3. Экспериментальная часть 118
3.1. Материалы 118
3 1 1 Реактивы 118
3 12 Пептиды, токсины, ферменты 118
313 Биологические материалы 119
3 14 Расходные материалы .119
3.2. Методы 119
32 1 Твердофазный синтез пептидов .119
3 2 2 Получение аналогов вещества Р, а-нейротоксинов из яда змей и а-конотоксинов 122
323 Получение радиоактивных соединений 124
3 24 Получение конъюгатов на основе полимерной пероксидазы 126
3 2 5 Тестирование рецептора вещества Р крысы на основе биотин стрептавидиновой системы .126
3 26 Получение поликлональных антител и их очистка 127
32 7 Взаимодействие антител с рецептором вещества Р крысы 128
3 28 Синтез аффинных сорбентов 129
3 2 9 Аффинная очистка рецептора вещества Р крысы 129
3 2 10 Очистка токсических компонентов ядов змеи и их взаимодействие с рецептором вещества Р крысы 130
3 2 11 Вьщеление, характеристика и ренатурация субъединиц нАХР Т cahformca 130
3 2 12 Получение внеклеточных доменов а7 нАХР крысы и их характеристтика 131
3 2 13 Радиолигандный анализ . 133
3 214 Метод изотермической титрующей калориметрии 136
3 2 15 Электрофизиологические эксперименты 136
3 2 16 Подбор условий фотоактивации для различных фотоактивируемых лшандов . 136
3 2 17 Эксперименты по фотомечению 137
3 2 18 Локализация фрагментов субъединиц нАХР, меченных [ I]rGI(Bpa12),
методами ферментативного протеолиза 139
3 2 19 N-концевое сиквенирование . 139
3 2 20 Кристаллография и рентгеноструктурный анализ 140
3 2 21 Компьюіерное моделирование 141
Выводы 143
Благодарности 145
Список литературы 146
