Введение
I. Обзор литературных данных 12
I. 1. Сворачивание белков 12
I. 1.1. Равновесное разворачивание/сворачивание большинства
глобулярных белков описывается переходом типа «все-или ничего» 14
I. 1.2. Кинетические процессы сворачивания/разворачивания белков.
Шевронные графики 16
I. 1.3. Промежуточные состояния белка, находящиеся «на пути» и «вне пути» сворачивания белка 23
I. 1.4. Структурные особенности промежуточных состояний белков 27
I. 1.5. Равновесное и неравновесное плавление белков 30
I. 2. Комплексные подходы, позволяющие исследовать процесс
самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков 37
I. 2.1. ф-Анализ 38
I. 2.2. -Анализ 40
I. 2.3. Генно-инженерные подходы при изучении сворачивания и стабильности белков 42
1.3. Характеристика белков, исследованных в работе 51
I. 3.1. КарбоксиангидразаБ 51
I. 3.2. Зеленый флуоресцентный белок 54
I. 3.3. Апомиоглобин 63
II. Экспериментальная часть
11.1. Материалы и методы 67
П. 1.1. Методы выделения и очистки препаратов 67
П. 1.2. Методы исследований и условия измерений 74 з
П. 2. Развитие экспериментальных методов и подходов для анализа процессов самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков
П. 2.1. Подход, позволяющий учесть влияние быстро образующихся (за мертвое время приборов) промежуточных состояний белка на последующие медленные фазы его сворачивания 82
П. 2.1(a). Исследование апомиоглобина 85
П. 2.1 (б). Исследование карбоксиангидразы 90
П. 2.1(B). Выводы 98
П. 2.2. Метод сканирующей калориметрии в применении к исследованию неравновесного плавления белков, разворачивающихся в несколько стадий 99
П. 2.2(a). Неравновесное плавление зеленого флуоресцентного белка 101
Прямой кинетический эксперимент по тепловому разворачиванию GFP-сусІеЗ 106
Сравнение констант скоростей тепловой денатурации, рассчитанных из калориметрических данных и из прямого кинетического эксперимента 108
Особенности структуры переходных и промежуточных состояний GFP-сусІеЗ 109
Последовательность этапов денатурации GFP-сусІеЗ 113
Исследование тепловой денатурации GFPметодом ЯМР... 114
Особенности флуоресценции хромофора GFP-сусІеЗ при денатурации белка 125
П. 2.2(6). Неравновесное плавление карбоксиангидразы 131
П. 2.2(B). Выводы 136
П. 2.3. Мутационный подход для определения последовательности сворачивания/разворачивания структурных элементов белка (ц анализ) 136
з II. 2.3(a). Влияние ss-мостиков и замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов на разворачивание белка с несколькими промежуточными состояниями 137
П. 2.3(6). Определение последовательности сворачивания структурных элементов зеленого флуоресцентного белка, используя ц-анализ 141
Теоретический анализ кристаллической структуры зеленого флуоресцентного белка 141
Исследования мутантних форм GFP-сусІеЗ 144
Анализ влияния мутаций на GFP-сусІеЗ 149
П. 2.3(B). Определение последовательности сворачивания структурных элементов карбоксиангидразы, используя ц-анализ 153
Выбор мутаций в карбоксиангидразе 154
Исследование мутантних форм карбоксиангидразы 156
П. 2.4. Выводы 160
П. 3. Направленное изменение энергетического ландшафта глобулярных белков 161
П. 3.1. Влияние замен гидрофобных аминокислотных остатков белка на его переходные состояния 162
П. 3.2. Влияние различных видов мутаций на состояние белка типа расплавленной глобулы 167
П. 3.2(a). Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков в гидрофобном ядре белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина ... 168
П. 3.2(6). Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина... 171
П. 3.2(B). Исследование влияния ss-связи на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина 175
4 П. 3.3. Влияние ss-связи на энергетический ландшафт многостадийно сворачивающегося белка 177
П. 4. Пример стабилизации одностадийно сворачивающегося белка введением цистеинового мостика 183
III. Заключение 188
Список литературы
