Введение
Обзор литературы
Агробактериальная трансформация растений в биотехнологии
Метод агробактериальной трансформации in vitro
Трансформация эксплантов
Трансформация листовых дисков
Трансформация корней Трансформация протопластов
Агробактериальная трансформация in planta
Факторы, влияющие на эффективность агробактериальной трансформации
Генетическая трансформация однодольных растений
Клетки-мишени генеративных тканей при агробактериальной трансформации in planta
Горизонтальный перенос ДНК с участием агробактерий
Экстраклеточные структуры агробактерий, участвующие в контакте с поверхностью клетки-реципиента
Полисахаридные структуры
Белковые структуры, принимающие участие в
агробактериальной трансформации Рикадгезин
Жгутики агробактерий Пили
Бактериальная система IV типа секреции (T4SS) Белки, участвующие в переносе субстрата T4SS Структура T4SS комплекса Перенос Т-ДНК через мембраны
Возможность переноса Т-ДНК через мембраны клетки-реципиента с помощью эндоцитоза Транспорт крупных молекул и частиц в клетку Эндоцитоз Типы эндоцитоза Участие в эндоцитозе малых ГТФ-связывающих белков 67
1.6 Перенос Т-комплекса в эукариотическую клетку 69
1.6.1 Взаимодействие VirD2 и VirЕ2 с эукариотическими белками-переносчиками 69
1.6.2 Роль белка VirE2 в процессе агробактериального переноса Т-ДНК 73
1.6.3 Трехмерная структура белка VirE2 80
1.7 Заключение по главе 83
Глава 2 Материалы и методы исследования 86
2.1 Реагенты 86
2.2 Бактерии
2.2.1 Штаммы, плазмиды E. coli 86
2.2.2 Штаммы, использованные для клонирования гена virE2 и выделения рекомбинантного белка VirE2 87
2.2.3 Штаммы A. tumefaciens 87
2.2.4 Схемы плазмид и области Т-ДНК используемых в работе бинарных векторов 88
2.2.5 Среды и условия для культивирования бактерий, буферные растворы 89
2.3 Молекулярно-генетические методы 90
2.3.1 Выделение плазмидной ДНК 90
2.3.2 Выделение тотальной ДНК растений 91
2.3.3 Клонирование гена virE2 92
2.3.4 Определение маркерных генов Т-ДНК методом ПЦР 92
2.3.5 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале 93
2.3.6 Рестрикция ДНК 94
2.3.7 Электрофорез ДНК 94
2.3.8 Электрофорез препаратов белка 95
2.3.9 Выделение и очистка рекомбинантного белка VirE2 95
2.3.10 Определение суммарного количества белка 2.4 Получение миниантител к белку VirE2 96
2.5 Метод иммунодота 96
2.6 Конъюгация фага М13 с ТРИТЦ 97
2.7 Определение способности белка VirE2 связываться с одноцепочечной ДНК 98
2.8 Получение оцДНК и формирование ДНК-белковых комплексов 98
2.8.1 Получение оцДНК для атомно-силовой микроскопии 98
2.8.2 Получение оцДНК для трансмиссионной электронной микроскопии 99
2.8.3 Получение оцДНК для метода динамического рассеяния света 99
2.8.4 Получение оцДНК для изучения переноса оцДНК в клетки HeLa и СПЭВ 100
2.8.5 Формирование ДНК-белковых комплексов для трансмиссионной электронной микроскопии
2.9 Определение размеров белков и комплекса оцДНК-VirE2 методом динамического рассеяния света 101
2.10 Растения
2.10.1 Обработка растений при проведении агробактериальной трансформации in planta 102
2.10.2 Выращивание растений, первичный отбор трансформантов 102
2.10.3 Количественное определение содержания свободного пролина в листьях кукурузы 103
2.10.4 Определение плоидности у проростков кукурузы 104
2.10.5 Гистохимический метод определения активности фермента -глюкуронидазы у проростков кукурузы и
сорго после проведения трансформации in planta 104
2.10.6 Агробактериальная трансформация пыльцы кукурузы 105
2.11 Клетки животных (СПЭВ) и человека (HeLa) 106
2.11.1 Выращивание клеток 106
2.11.2 Измерение флуоресценции 106
2.11.3 Обработка клеток ингибиторами 107
2.12 Микроскопия 107
2.12.1 Световая микроскопия 107
2.12.2 Трансмиссионная электронная микроскопия 108
2.12.3 Атомно-силовая микроскопия
2.13 Методы биоинформатики 109
2.14 Статистическая обработка данных 110
Глава 3 Результаты и их обсуждение 111
3.1 Изучение свойств и роли белка VirE2 в переносе
оцДНК 111
3.1.1 Клонирование гена, кодирующего белок VirE2 из
A. tumefaciens 112
3.1.2 Выделение рекомбинантного белка VirE2 113
3.1.3 Получение очищенного препарата белка VirE2 с помощью аффинной хроматографии 114
3.2 Изучение свойств рекомбинантного белка VirE2 116
3.2.1 Анализ способности белка VirE2 связываться с одноцепочечной ДНК и защищать ее от деградации нуклеазами 116
3.2.2 Анализ формирования Т-комплекса in vitro микроскопическими методами
3.2.2.1 Трансмиссионная электронная микроскопия Т-комплекса in vitro 119
3.2.2.2 Атомно-силовая микроскопия Т-комплекса in vitro
3.3 Измерение размеров комплексов, образованных оцДНК-VirE2, методом ДРС 125
3.4 Проверка активности белка VirE2 при заморозке-оттаивании 128
3.5 Получение миниантител к белку VirE2 131
3.5.1 Идентификация белка VirE2 с помощью антител 135
3.6 Исследование взаимодействия белка VirE2 с модельной липидной мембраной 137
3.7 Компьютерное моделирование комплексов, образованных двумя и четырьмя молекулами белка VirE2 в мембране 142
3.8 Эксперименты по переносу оцДНК с участием белка VirE2 и его комплексов через мембраны
3.8.1 Эксперименты по переносу олигонуклеотидов с участием белка VirE2 через мембраны животных клеток 152
3.8.2 Эксперименты по переносу оцДНК (200 н.о.) с участием белка VirE2 в клетки СПЭВ
3.9 Перенос Т-ДНК из A. tumefaciens в однодольные растения (кукуруза, сорго) при агробактериальной трансформации in planta 161
3.9.1 Перенос Т-ДНК из A. tumefaciens в кукурузу при агробактериальной трансформации in planta 163
3.9.1.1 Определение эффективности трансформации кукурузы через пестичные нити с использованием разных штаммов и линий кукурузы в поколениях T0 170
3.9.1.2 Определение эффективности трансформации кукурузы в поколении T1 175
3.9.1.3 Определение эффективности трансформации in planta с использованием конструкции с антисмысловой последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы 176
3.10 Агробактериальная трансформация сорго in planta 184
3.11 Анализ клеток-мишеней для встраивания агробактериальной Т-ДНК в женский и мужской гаметофиты кукурузы
3.11.1 Трансформация клеток женского гаметофита кукурузы в условиях in planta 194
3.11.2 Трансформация пыльцы кукурузы суспензией агробактерий in vitro 201
3.12 Перенос T-ДНК в неповрежденную растительную клетку 205
3.12.1 Перенос T-ДНК в неповрежденные проростки табака 205
3.12.2 Перенос T-ДНК в неповрежденные проростки риса и пшеницы 208
3.12.3 Агробактериальная трансформация неповрежденных проростков табака: возможное участие устьиц и цитоскелета 209
3.13 Изучение ядерно-локализованных
последовательностей белков VirE2 и VirD2 из
A. tumefaciens при переносе Т-ДНК через ядерные
поры эукариотических клеток 216
3.13.1 Поиск сайтов связывания с ДНК у белка VirE2 220
Заключение 222
Выводы 225
Список сокращений и условных
Обозначений 227
Список литературы
