Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Геномная организация вируса гепатита С 11
1.1.1. Нетранслируемые области 14
5 UTR 14
3 UTR 14
1.1.2. Белки ВГС 14
1.1.2.1. Структурные белки 15
Кор белок ВГС, структурный белок капсида 15
Белки оболочки ВГС 17 р7 19
1.1.2.2. Неструктурные белки 19
NS2 19
NS3HNS4A 19
NS4B 20
NS5A 20
NS5B 21
1. 2. Жизненный цикл вируса 22
1.2.1. Проникновение вирусных частиц в клетку 22
1.2.1.1. Прикрепление и проникновение 23
CD-81- рецептор LDLR - рецептор 24
SR-BI - рецептор мусорщик 24
Гликозаминогликаны 25
1.2.1.2. Выход в цитоплазму и раздевание РНК вирусного генома 25
1.2.2. Трансляция ВГС и протеолитический процессинг 27
1.2.3. Репликация ВГС 29
1.2.4. Сборка вирусной частицы 31
1.3. Морфогенез вируса гепатита С 36
1.3.1. Биогенезис гликопротеинов оболочки вируса гепатита С 36
Посттрансляционный процессинг белков 38
1.3.2. Гликозилирование гликопротеинов в клетках насекомых 42
1.3.3. Гликозилирование гликопротеинов в клетках млекопитающих 50
1.3.4. N-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса 52
1.4. Методы исследования гликозилирования белков оболочки ВГС 55
1.4.1. Сайт-направленный мутагенез ДНК 55
1.4.2. Получение вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых 59
1.4.3. Использование ВасМат системы в клетках млекопитающих 64
1.5. Модельные системы для изучения вирусного морфогенеза 67
1.5.1. Ретровирусные псевдочастицы (HCVpp) 68
1.5.2. Вирусоподобные частицы (HCV-LP) 69
1.5.3. Система репликонов ВГС
1.5.3.1. Системы репликации с использованием самореплицирующихся РНК. JFH-1 репликоныВГС 72
1.5.3.2. Использование бакуловируса для доставки и капсидирования JFH-1 РНК в клетках Huh-7 73
2. Экспериментальная часть 77
2.1. Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды 77
2.2. Сайт-направленный мутагенез и создание рекомбинантных конструкций 77
2.3. Анализ суммарной клеточной ДНК 79
2.4. Получение микросом 79
2.5. Электронная микроскопия 80
2.6. Анализ РНК ВГС с помощью ОТ-ПЦР 80
2.7. Вестерн-блот и иммуноосаждение 81
2.8. Анализ гликозилирования - обработка эндогликозидазой Н (Endo Н)...82
2.9. Получение и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ) 2.10. Центрифугирование в сахарозном градиенте 83
2.11. Анализ связывания ВПЧ с рецептором CD-81 83
2.12. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия 83
2.13. Моделирование трехмерной структуры 84
3. Результаты и обсуждение 85
3.1 Создание набора векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах N-гликозилирования белков Е1 и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих 85
3.2. Экспрессия мутантных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии 87
3.2.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих 87
3.3. Исследование роли гликозилирования белков оболочки ВГС в вирусном морфогенезе в клетках насекомых и млекопитающих
3.3.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование продуктивного комплекса Е1Е2 в клетках 5/9 95
3.3.2. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих 98
3.3.3. Влияние N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на связывание рекомбинантных вирусоподобных частиц ВГС, полученных в модельной бакуловирусной системе, с рецептором CD-81 в клетках Huh 7 105
4. Моделирование пространственной структуры мутантных белков Е1 ВГС 106
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 114
Благодарности
