Введение
I. Обзор литературы 6
1. Малые белки теплового шока (sHsp) 6
1.1 Структура малых белков теплового шока 7
1.2 Фосфорилирование малых белков теплового шока . 12
1.3 Малые белки теплового шока человека 13
1.4 Некоторые функции малых белков теплового шока человека 15
1.4.1 Предотвращение накопления белковых агрегатов 15
1.4.2 Защита клеток от апоптоза 16
1.4.3 Взаимодействие малых белков теплового шока с элементами цитоскелета 19
1.4.4 Внеклеточные функции малых белков теплового шока 23
2. Флуоресцентные белки 24
3. Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока 30
4. Линкерные последовательности в химерных белках 32
II. Цели и задачи 35
III. Материалы и методы 36
1. Получение молекулярно-генетических конструктов 36
2. Получение химически компетентных клеток E. coli 38
3. Экспрессия химерных белков 38
3.1 Выращивание бактериальных культур 40
3.2 Тестовая экспрессия 41
3.3 Препаративная экспрессия 42
4. Выделение и очистка рекомбинантных белков 43
4.1 Выделение и очистка химерных белков 43
4.2 Выделение и очистка белков из телец включения с последующей ренатурацией 46 4.3. Выделение и очистка рекомбинантных флуоресцентных белков 47
5. Исследование олигомерного состояния 48
5.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков 48
5.1.1 Динамическое лазерное светорассеяние 48
5.1.2 Гель-хроматография 48
5.1.3 Электронная микроскопия 49
5.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков 50
6. Флуоресцентные методы исследования 51
6.1 Измерение спектров возбуждения и флуоресценции химерных белков 51
6.2 Исследование взаимодействий химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) 52
6.2.1 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между разными флуоресцентными белками (гетеро-FRET) 52
6.2.2 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между одинаковыми флуоресцентными белками (гомо-FRET) 53
6.2.3 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гетеро-FRET 54
6.2.4 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гомо-FRET 54
7. Исследование шапероноподобной активности 56
8. Некоторые аналитические методы 57
8.1 SDS-электрофорез по методу Леммли 57
8.2 Иммунохимическое окрашивание (Western Blotting) 58
8.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка 59
IV. Результаты и их обсуждение 62
1. Подбор условий экспрессии химерных белков 62
2. Выделение и очистка белков 65
2.1 Выделение и очистка химерных белков 65
2.2 Выделение химерных белков из телец включения 69
3. Исследование олигомерного состояния химерных белков 71
3.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков 72
3.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков 79
4. Шапероноподобная активность химерных белков 91
V. Заключение 96
Выводы: 97
Список литературы: 98
