Введение
1.1 Введение: классификация клеточных рецепторов, про- и эукариотические рецепторы класса І 13
1.2 Галобактериальный трансдьюсер 2 из Natronobacterium pharaonis 14
1.2.1 Фототаксис в Natronobacterium pharaonis: сенсорный родопсин 2 и трансдьюсер 2 14
1.2.2 Хемотаксис в Escherichia coli и Salmonella typhymurium: аспартатный и сериновый рецепторы 17
1.2.3 Современные представления о механизмах передачи сигнала в системах фото- и хемотаксиса 20
1.3 Рецептор фактора роста эпидермиса человека 24
1.3.1 Физиология и структура рецептора фактора роста эпидермиса человека 24
1.3.2 Современные представления о механизмах передачи сигнала рецептором фактора роста эпидермиса человека 27
1.4 Формулировка целей диссертационной работы 28
Материалы и методы
2.1 Оборудование и материалы 29
2.1.1 Оборудование 29
2.1.2 Материалы и химические реагенты 32
2.1.2.1 Ферменты для генной инженерии 32
2.1.2.2 Праймеры 32
2.1.2.3 Маркеры для гель-электрофореза 34
2.1.2.4 Носители для хроматографических колонок 34
2.1.2.5 Детергенты и липиды 35 2.1.3 Растворы 35
2.1.3.1 Буферные растворы для работы с ДНК 36
2.1.3.2 Буферные растворы для секвенирования 36
2.1.3.3 Буферные растворы для агарозного гель-электрофореза 36
2.1.3.4 Буферные растворы для гель-электрофореза в ДСН 36
2.1.3.5 Буферные растворы для иммунноблоттинга 37
2.2 Клонирование, работа с Exoli и клетками млекопитающих 37
2.2.1 Бактериальные штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы
37
2.2.1.1 Бактериальные штаммы и клеточные линии 37
2.2.1.2 Плазмидные векторы 38
2.2.1.3 Питательные среды и пищевые добавки 38
2.2.2 Методы клонирования 42
2.2.2.1 Агарозный гель-электрофорез 42
2.2.2.2 Определение первичной последовательности ДНК 42
2.2.2.3 Полимеразная цепная реакция 42
2.2.2.4 Очистка продуктов полимеразной цепной реакции 43
2.2.2.5 Цитирование вставки в плазмидный вектор 43
2.2.3 Работа с клетками Exoli АА
2.2.4 Работа с клетками линии COS-1 44
2.2.5 Работа с клетками линии НЕК 293S 46
2.3 Очистка и приготовление образцов белков 48
2.3.1 Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 48
2.3.2 Выделение и очистка цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 49
2.3.3 Выделение и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 50
2.3.4 Анализ качества рекомбинантных белков 51
2.3.4.1 Полиакриламидный гель-электрофорез в ДСН 51
2.3.4.2 Иммунологический анализ 51
2.3.4.3 Измерение концентрации белков 53 2.4 Биофизические и биохимические методы исследования белков 54
2.4.1 Масс-спектрометрия 54
2.4.2 Круговой дихроизм 54
2.4.3 Ядерный магнитный резонанс 54
2.4.4 Инфракрасная Фурье-спектроскопия 55
2.4.5 Аналитическая гель-фильтрационная хроматография 55
2.4.6 Кросс-линкинг 55
2.4.7 Малоугловое рассеяние нейтронов 56
2.4.8 Атомная силовая микроскопия 56
3. Результаты и их обсуждение: галобактериальныи трансдьюсер 2 из Natronobacterium pharaonis
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 58
3.2 Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 59
3.3 Вторичная структура и конформационные изменения цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
61
3.3.1 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кругового дихроизма 61
3.3.2 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью ядерного магнитного резонанса 69
3.3.3 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии 72
3.4 Олигомеризация и агрегация цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 73
3.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью аналитической гель-фильтрационной хроматографии 73
3.4.2 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кросс-линкинга 74
3.5 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 77
3.5.1 Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью малоуглового рассеяния нейтронов 77
3.5.2 Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью атомной силовой микроскопии 83
3.6 Предсказания конформационной подвижности и вторичной структуры: сравнительный анализ 84
3.7 Модель передачи сигнала в системе сенсорный родопсин 2-галобактериальный трансдьюсер 2 в Natronobacterium pharaonis
4. Результаты и их обсуждение: фактор роста эпидермиса человека
4.1 Клонирование и экспрессия внеклеточного + трансмембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 89
4.2 Клонирование, экспрессия, очистка и характеризация цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 91
4.3 Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 95
4.4 Олигомеризация и агрегация трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 97
4.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кросс-линкинга 97
4.5 Структура и конформационные изменения трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 99
4.5.1 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кругового дихроизма 99
4.5.2 Исследование структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью ядерного магнитного резонанса 102
Выводы 105
Список использованной литературы
