Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Интеграция чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих 11
1.2 Вопрос об экстрахромосомном существовании пДН К у млекопитающих.. 14
1.3 Нестабильность интеграции чужеродной ДНК 16
1.3.1 Нестабильность интеграции вирусной ДНК 16
1.3.2 Нестабильность интеграции плазмидной ДНК 18
1.3.3. Влияние копийности на интеграцию ДНК 22
1.3.4 Влияние метилирования на интеграцию ДНК 23
1.3.5. Проявление генетической нестабильности интегрированных ДНК на модели трансгенных мышей 25
1.4. Наиболее вероятный механизм нестабильности чужеродной ДНК - рекомбинация 27
1.4.1. Гомологичная рекомбинация 27
1.4.2. Гомологичная рекомбинация и таргетинг генов 31
1.4.3. Различные проявления негомологичной рекомбинации 35
1.5. Молекулярные механизмы ре комбинационных явлений 38
1.5.1. Строение и биохимические свойства белка RecA 38
1.5.2. Распространение семейства RecA-подобных белков 40
1.5.3. Гомологи белка RecA у эукариот и их функции 42
1.5.4. Другие белки, взаимодействующие с RecA/Rad51, и необходимые для рекомбинации 46
1.5.5. Белки SSB и RPA 48
1.5.6. Белок Rad54 50
1.5.7. Белки BRCA1 и BRCA2 51
1.5.8. Другие белки, способствующие рекомбинации 52
1.5.9. Оверэкспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих 53
1.5.10. Белки, осуществляющие негомологичное воссоединение концов ДНК 54
1.5.11. Изменения в структуре хроматина, происходящие во время негомологичного воссоединения концов ДНК 56
Глава 2. Материалы и методы 59
2.1. Культуры клеток 59
2.2. Плазмиды, использованные в работе 59
2.3. Электропорация; получение и селекция TlC клеток линии А23 60
2.4. Анализ наличия трансгенной ДНК в клетках 61
2.4.1. Выделение ДНК 61
2.4.2. Подготовка геномной ДНК для использования в качестве вектора для трансфекции 62
2.4.3. Анализ методом ПЦР 63
2.4.4. СеквенированиеДНК 63
2.5. Анализ экспрессии гена тимидинкиназы вируса герпеса 64
2.6. Получение и анализ клонов клеток млекопитающих, экспрессирующих белок RecA 64
2.6.1. Вестерн-блот 65
2.6.2. Comet assay 67
2.7. Статистическая обработка результатов 68
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1. Изучение феномена нестабильности 69
3.2. Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из генома культивируемых клеток линии А23 79
3.3. Проявление нестабильности интеграции чужеродной ДНК различных плазмидных конструкций на разных клеточных линиях 85
3.4. Поиск и исследование факторов, влияющих на нестабильность 87
3.4.1. Облучение у-радиацией 87
3.4.2. Влияние усиления гомологичной рекомбинации за счет экспрессии бактериального белка RecA 89
3.4.2.1. Получение клеточных линий, экспрессирующих RecA 89
3.4.2.2. Проверка наличия гена RecA в трансфецированных клетках и его экспрессии 91
3.4.2.3. Проверка работоспособности белка RecA в эукариотических клетках: .облучение и Comet assay 95
3.4.2.4. Нестабильность чужеродной пДНК в клетках, экспрессирующих RecA 101
3.4.3. Конструирование плазмиды, содержащей последовательности флангов интеграции, и ее анализ 103
3.4.3.1. Стратегия получения плазмиды, содержащей фланги места интеграции в геном плазмиды р16 103
3.4.3.2. Выбрасывание из генома клеток линии А23
ДНК "вторичной " плазмиды р42 33 106
3.4.3.3. Определение нуклеотидной последовательности флангов места интеграции в геном первоначальной плазмиды 109
Глава 4. Обсуждение 110
Выводы 120
Список цитируемой литературы
