ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Матричный принцип в биологии. Матрицы I и II рода
(линейные и пространственные матрицы) 13
1.2 Амилоиды и прионы 19
1.3 Прионы низших эукариот 23
1.4 Функциональные амилоиды 27
1.5 Объекты и модели изучения взаимодействия амилоидогенеза и процессов,
участвующих в контроле стабильности генома 29
1.6 Амилоиды и эффективность репарации 33
1.7 Амилоиды и геномные мутации 34
1.8 Роль амилоидогенеза в канцерогенезе 37
1.9 Подходы, применяемые для решения задачи исследования 41
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1 Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе 44
2.2 Среды и условия культивирования 45
2.3 Плазмиды 46
2.4 Индукция прионизации Sup35 46
2.5 Флуоресцентная микроскопия 46
2.6 Определение частоты прионизации 47
2.7 Стандартные методы генетики дрожжей 47
2.8 Транформация дрожжевых клеток плазмидной ДНК 47
2.9 Трансформация дрожжевых клеток лизатом клеток, содержащим прион 48
2.10 Альфа-тест 49
2.11 Определение частоты прямых мутации устойчивости к канаванину
в гене CAN1 51
2.12 Определение частоты полиплоидизации 52
2.13 Определение частоты совместного возникновения приона [PSI+
] и прямых
мутаций в гене CAN1 53
2.14 Проточная цитометрия 53
2.15 Выделение геномной ДНК из клеток дрожжей S. cerevisiae 54
3
2.16 Полногеномное секвенирование 55
2.17 Статистические методы 55
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 56
3.1 ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ МУТАГЕНЕЗА У ШТАММОВ С [PSI+
] И [PIN+
]
ИЗ КОЛЛЕКЦИИ КАФЕДРЫ ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ СПбГУ 56
3.1.1 Фенотипическая характеристика штаммов с прионом [PSI+
] 56
3.1.2 Фенотипическая характеристика штаммов с прионом [PIN+
] 57
3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИОНА [PSI+
] НА ЧАСТОТУ
ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 58
3.2.1 Создание коллекции штаммов [PSI+
] и их фенотипическая
характеристика 58
3.2.2 Параметры спонтанного и индуцированного УФ-мутагенеза
штаммов [PSI+
] с измененным значением частоты «незаконной»
гибридизации 61
3.2.3 Спектр генетических изменений, учитываемых в альфа-тесте
у штаммов [PSI+
] - 2-5 и 127 64
3.2.4 Проверка прямого влияния приона [PSI+
] на стабильность
генетического материала 65
3.3 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ
В ШТАММАХ [PSI+
] 68
3.3.1 Генетические изменения, обнаруженные в штаммах [PSI+
] с
измененными параметрами мутагенеза 68
3.3.2 Генетический анализа штаммов [PSI+
] с- 127 и [PSI+
] - 2-5 71
3.4 ВЛИЯНИЕ ПРИОНА [PSI+
] НА ЧАСТОТУ ДУПЛИКАЦИИ ГЕНОМА 74
4
3.5 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАРУШЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ
В ПОДДЕРЖАНИИ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА НА ЧАСТОТУ
ПРИОНИЗАЦИИ Sup35 75
3.5.1 Влияние ингибирования синтеза предшественников ДНК дНТФ
на частоту прионизации Sup35 77
3.5.2 Результаты исследования влияния дизрупции гена RAD52
на частоту возникновения приона [PSI+
] 78
3.6 ЧАСТОТА ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЯВЛЕНИЯ ПРИОНА [PSI+
] И
ИЗМЕНЕНИЙ ГЕНОМА 80
3.6.1 Частота появления клонов с измененными параметрами мутагенеза
при прионизации белка Sup35 80
3.6.2 Частота одновременного появления приона [PSI+
] и мутаций
в гене CAN1 83
4 ОБСУЖДЕНИЕ 86
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
6 ВЫВОДЫ 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93
