Введение
Глава 1 8
Обзор литературы 8
1.1 Физико-химические и структурные особенности ДНК 8
Природа взаимодействий ДНК с молекулами-лигандами 9
Особенности взаимодействий ДНК с молекулами-лигандами и их роль в регуляции
транскрипции 9
Реализация генетического материала в эукариотической клетке 10
Транскрипция нерибосомных генов 11
1.2 Структура хроматина 11
Нуклеосома 12
РНК-полимеразы 13
Механизм транскприпции одиночной РНКПП, нуклеосомные барьеры 15
Молекулярные механизмы преодоления нуклеосомного барьера РНКПП 17
Механизмы транскрипции РНКПП in vivo 20
1.3 Поддержание постоянства генетического материала 21
1.4 Факторы, способные приводить к остановке транскрипции 22
Остановка транскрипции молекулами-лигандами ДНК 22
Роль однонитевых разрывов ДНК в остановке транскрипции 22
1.5 Методы исследования структурных особенностей макромолекулярных комплексов 25
Основы метода Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 26
Принцип формирования изображений в ПЭМ 30
Методы получения ПЭМ изображений 32
Контраст изображений 34
Определение частотно-контрастной характеристики (ЧКХ) 36
Элиминирование эффектов частотно-контрастной характеристики (ЧКХ-коррекция) 36
Нормализация изображений 37
1.6 Трехмерная реконструкция карт электронной плотности из ПЭМ-изображений 38
Сборка изображений одиночных частиц 39
Статистический анализ и классификация изображений 40
Мультиреференсное выравнивание изображений 42
Выравнивание в томографии 42
Определение ориентации двумерных изображений 43
Угловая реконструкция трехмерной структуры з
1.7 Методы компьютерного моделирования и их роль в анализе трехмерных структур 49
Методы компьютерного докинга и фиттинга 49
Метод молекулярной динамики 51
Глава II 58
Материалы и методы 58
2.1. Материалы 58
2.2. Методы 59
Подготовка проб для ПЭМ-исследования 59
Нанесение проб на сетки для ПЭМ 62
Проведение исследований методами ПЭМ 62
Проведение расчетов методом молекулярной динамики 64
Глава III 65
Результаты 65
3.1 Исследования ЭК, остановленного в положении активного центра РНКП E.Coli +42
позиции нуклеосом-позиционирующей последовательности 65
3D структура ЭК(+42), полученная с использованием метода негативного контрастирования 65
Получение 3D структуры ЭК(+42) методом крио-ПЭМ 67
3.2 Исследования элонгационного комплекса, остановленного в положении +24 активного центра РНКП E.Coli 68
Получение предварительной реконструкции ЭК(+24) с использованием электронной томографии 68
Получение 3D структуры ЭК(+24) с использованием метода RCT и негативного контрастирования. 70
3.3. Применение молекулярно-динамического подхода для исследования влияния введения
однонитевого разрыва на механические параметры (жесткость и гибкость) фрагмента ДНК 73
Создание моделей исследуемых структур фрагмента ДНК без однонитевого разрыва и с
однонитевым разрывом 73
Оценка влияния введения однонитевого разрыва на жесткость ДНК 75
Оценка влияния введения однонитевого разрыва на характер стэкинг-взаимодействий в
области разрыва ДНК 76
Глава IV 78
Обсуждение 78
4.1. Интерпретация структурных особенностей элонгационного комплекса, остановленного в положении +42 активного центра РНКП E.Coli 78
Анализ 3D структуры ЭК, остановленного в положении +42 активного центра РНКП E.
Coli, полученной методом крио-ПЭМ 79
Анализ 3D структуры ЭК, остановленного в положении +42 активного центра РНКП
E.Coli, полученной методом ПЭМ негативного контрастирования 80
Сравнение и анализ 3D структур ЭК(+42), полученных методами негативного контрастирования и крио-ПЭМ. 84
4.2. Влияние однонитевого разрыва ДНК на структурные особенности элонгационного комплекса, остановленного в положении +24 активного центра РНКП Е. Coli 87
4.3. Оценка влияния введения однонитевого разрыва на механические свойства ДНК 94
Заключение 99
Выводы 100
Благодарности
