Введение
Обзор литературы 11
1 Структура транскетолазы 12
1.1 Сравнение структур апо-и холотранскетолазы 14
1.2 Структура активного центра транскетолазы 17
1.2.1 Связывание двухвалентных катионов 17
1.2.2 Структура кофермент-связывающего участка активного центра транскетолазы 17
1.2.3 Протонный канал 21
1.2.4 Субстратный канал 22
1.2.5 Интермедиат транскетолазной реакции 25
2 Механизм транскетолазной реакции 27
3 Взаимодействие кофермента с апотранскетолазой 31
4 Участие двухвалентных катионов в связывании тиаминдифосфата апотранскетолазой 38
5 Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы 40
5.1 Неэквивалентность по связыванию кофермента 40
5.2 Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков 41
6 Оптические свойства транскетолазы 44
Экспериментальная часть 47
1 Материалы 47
2 Методы 47
2.1 Выделение транскетолазы 47
2.2 Определение концентрации транскетолазы 48
2.3 Определение концентрации тиаминдифосфата и его аналогов 48
2.4 Определение активности транскетолазы 48
2.4.1 С использованием глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента 48
2.4.2 По скорости окисления а-карбанионного интермедиата в присутствии феррицианида 49
2.5 Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата 50
2.6 Определение концентрации рибозо-5-фосфата 51
2.7 Определение IQ для тиаминдифосфата 51
2.8 Исследование кинетики диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы 52
2.9 Разностные спектры поглощения транскетолазы 54
2.10 Спектрофотометрическое титрование 54
2.11 Расчет Kd для тиаминдифосфата по результатам спектрофотометрического титрования 57
2.12 Stopped flow кинетика связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой 58
2.13 Спектры кругового дихроизма 58
2.14 Триптофановая флуоресценция 58
2.15 Дифференциальная сканирующая калориметрия 59
2.16 Кинетика термоденатурации 59
Результаты и обсуждение 61
1 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы из апо- и кофермента 61
1.1 Разностные спектры поглощения холотранскетолазы 61
1.2 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Са2+ 63
1.3 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg 65
1.3.1 Влияние необратимо расщепляемого субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+... 66
1.3.2 Влияние обратимо расщепляемых субстратов-доноров на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+ 68
1.4 Реконструкция холотранскетолазы в присутствии Mg2+ и субстрата-акцептора 72
1.5 Взаимодействие апотранскетолазы с неактивным аналогом тиаминдифосфата - N3-пиридил-тиаминдифосфатом 75
1.6 Исследование влияния субстрата-донора на постадийное взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом 80
1.6.1 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Са2+ 81
1.6.2 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Mg2+ 86
1.6.3 Влияние субстратов-доноров на кинетику диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы.. 91
2 Атипичные субстраты-доноры транскетолазы 97
3 Влияние кофакторов транскетолазы на ее конформацию и стабильность 108
3.1 Влияние двухвалентных катионов на спектры кругового дихроизма транскетолазы в дальнем ультрафиолете 109
3.2 Влияние кофакторов транскетолазы на ее стабильность 112
3.3 Исследование стабильности холоТК, в зависимости от типа катиона в ее составе (Са2* или Mg24"), методом триптофановой флуоресценции в присутствии мочевины 115
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
