Введение
Обзор литературы 10
1. Молекулярные механизмы старения 10
1 1 Роль соматических мутаций 11
1.2 Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса 11
1.3 Накопление измененных белков 16
1.4. Нарушения метаболизма Сахаров 20
1.5 Метилирование ДНК и старение 21
1.6 Репарация ДНК и старение 23
1.1 Утрата теломер и старение 25
1.8 Апоптоз и продолжительность жизни 27
2. Изменение основных характеристик рибосомных генов млекопитающих при старении 30
2.1 Структурно-функциональная организация рибосомных генов 30
2.2 Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих 33
2.2.1 Число копий рибосомных повторов в геноме человека 34
2.2.2 Изменение числа копий рДНК при старении 35
2.3 Активные копии рибосомных генов в геноме человека 36
2.3.1 Селективная окраска ядрышкообразующих районов метафазных хромосом 36
2.3.2 Изменение активности рибосомных генов при старении 39
Материалы и методы 42
1. Анализируемая выборка 42
2. Выделение ДНК из периферической крови, клеточной массы и среды культивирования фибробластов 42
3. Определение концентрации ДНК 42
4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома человека в яДНК и в вкДНК 43
5. Определение относительного количества активных РГ (АкРГ) 44
6. Исследование репликативного старения и действия хромата калия на культивируемые фибробласты 45
7. Количественная оценка гена 18S рРНК методом real-time ПЦР 47
9. Статистическая обработка результатов 49
Результаты и обсуждение 50
1. Свойства комплекса РГ людей среднего и старшего возраста 50
1.1 Число копий РГ в геноме 50
1.2 Анализ содержания трех контрольных повторяющихся последовательностей генома человека в группе СВ и ГС 52
1.2.1 Теломерный повтор 52
1.2.2 Гистоновые гены 54
1.2.3 Сателлит 3 (lql2) 55
1.3 Относительные количества активных копий РГ 57
1.4 Изменение количества метилированных копий РГ при старении 59
2. Влияние свойств комплекса РГ на решшкативное старение 60
2.1 Основные характеристики штаммов фибробластов кожи человека 60
2.1.1 Свойства комплекса РГ 62
2.1.2 Маркеры репликативного старения 63
2.1.3 Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения 67
3. Изменения свойств комплекса РГ при репликативном старении 67
3.1 Изменение содержания контрольных повторов (ТП и СатШ) 68
3.2 Изменение содержания РП и уровня метилирования РП 69
3.3 Повреждение ДНК рибосомных генов при репликативном старении 71
4. Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого хроматом калия 74
4.1 «Ранний» ответ фибробластов на действие «малых» доз К2Сг04 75
4.1.1 Изменение количества клеточной РНК 75
4.1.2 Изменение активности ядрышка 77
4.1.3 Изменения уровня апоптоза 79
4.2 «Поздний» ответ фибробластов на действие хромата калия 81
5. Влияние количества АкРГ в геноме на нуклеазную активность клеток 86
5.1 Уровень нуклеазной активности в штаммах фибробластов при стандартных условиях культивирования 87
5.2 Изменения НА клеток при действии малых доз хромата калия 89
5.3 Изменение НА в процессе апоптоза клеток («поздний» ответ на действие К2СЮ4) 90
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93
ВЫВОДЫ 101
Список литературы 102
4
