Введение
ГЛАВА 1. Введение 5
1.1. Актуальность проблемы 5
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 8
1.4. Научная новизна 9
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 10
1.6. Финансовая поддержка 10
1.7. Публикации 10
1.8. Апробация работы 10
1.9. Объем и структура диссертации 11
ГЛАВА 2. Обзор литературы 12
2.1. Убиквитин-протеасомный путь деградации белков 12
2.1.1. Протеасомы 12
2.1.2. Ферментативные активности протеасом 27
2.1.3. Убиквитин-зависимый протеолиз 31
2.1.4. Участие протеасом в важнейших клеточных процессах 36
2.1.5. Ингибиторы протеасом 42
2.2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза 47
2.3. Вовлечение убиквитин-протеасомного пути в апоптоз 50
2.3.1. Протеасомные ингибиторы как индукторы апоптоза 53
2.3.2. Ингибиторы протеасом могут также ингибировать апоптоз 57
2.3.3. Ингибиторы протеасом в терапии рака 59
ГЛАВА 3. Материалы и методы 64
3.1. Культивирование клеток 64
3.2. Анализ фрагментации клеточной ДНК 64
3.3. Флуоресцентная окраска хроматина 65
3.4. Выделение препаратов цитоплазматических РНК 65
3.5. Выделение препаратов ядерных и цитоплазматических протеасом 66
3.6. Флуориметрическое измерение протеолитической активности протеасом 67
3.7. Электрофорез РНК в нативных условиях 68
3.8. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях 68
3.9. Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP) 69
ЗЛО. Обработка РНК с помощью протеасом 69
3.11. Транскрипция in vitro 69
3.12. Анализ содержания субъединиц протеасом и их статуса фосфорилироваиия методом вестерн-блотинг 70
3.13. Диск-электрофорез белков по Лэммли 71
3.14. Двумерный электрофорез белков 71
3.15. Л/атсриалы 72
ГЛАВА 4. Результаты 73
4.1. Диэтилмалеат и доксорубицин вызывают апоптоз в клетках К562 73
4.2. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъединичном составе цитоплазматических протеасом 76
4.3. Популяция протеасом в клетке гетерогенна 78
4.4. После индукции апоптоза в клетках К562 субъединицы протеасом модифицируются 80
4.4.1. Цитоплазматические протеасомы 80
4.4.2. Ядерные протеасомы 83
4.5. При индукции апоптоза в клетках К562 измененяются ферментативные активности протеасом 83
4.5.1. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза изменяет специфичность протеолитической активности протеасом 88
4.5.2. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется специфичность эндорибонуклеазной активности протеасом 90
4.6. После индукции апоптоза в клетках К562 наблюдается модифицирование
субъединиц протеасом, ответственных за ферментативные активности протеасом:
а5, аб и р2 95
4.7. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется статус фосфорилироваиия протеасом 97
4.8. Дефосфорилирование субъединиц протеасом специфическим образом изменяет ферментативные активности протеасом, выделенных из клеток К562 100
4.8.1. Протеолитическая активность протеасом 101
4.8.2. Механизм регуляции протеолитической активности протеасом при индукции апоптоза связан с фосфорилированием (дефосфорилированием) протеасом 101
4.8.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом 103
ГЛАВА 5. Обсуждение 106
5.1. Изменения субъединичного состава протеасом при апоптозе в клетках К562108
5.2. Изменения ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562 ПО
5.3. Изменение статуса фосфорилирование протеасом при апоптозе в клетках К562 112
5.4. Неспецифическое дефосфорилирование белковых субъединиц протеасом изменяет специфичность их ферментативных активностей 114
Выводы 116
Список сокращений
