Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 10
2.1. Структура и свойства нормальной печени 10
2.2. Эпидемиология и патологические свойства гк 12
2.3. Стадии гепатоканцерогенеза 13
2.4. Патогенез гк 14
2.4.1. Хронический вирусный гепатит 16
2.4.2. Вирус гепатита В 17
2.4.3. Вирус гепатита С. 19
2.4.4. Химические канцерогены 22
2.4.5. Наследственные генетические нарушения 23
2.5. Свойства опухолевой клетки 24
2.5.1. Независимость от ростовых сигналов 26
2.5.2. Нечувствительность к сигналам, запрещающим рост 26
2.5.3. Уклонение от программы апоптоза. 27
2.5.4. Неограниченныйрепликативный потенциал 27
2.5.5. Способность к ангиогенезу. 28
2.5.6. Генетическая нестабильность. 28
2.5.7. Способность к инвазии и метастазированию. 29
2.5.8. Снижение уровня дифференцировки 30
2.6. Генетические механизмы гепатоканцерогенеза 30
2.6.1. Ранние изменения при гепатоканцерогенезе 31
2.6.2. Поздние события гепатоканцерогенеза 33
2.7. Гепатоцитариые ядерные факторы и их роль в регуляции генов печени 39
2.7.1. СемействоHNF1 41
2.7.2. Семейство С/ЕВР 45
2.7.3. СемействоHNF3 48
2.7.4. СемействоHNF4 51
2.7.5. СемействоHNF6 58
2.7.6. FTF. 60
2.7.7. Семейство GA ТА 61
2.7.8. Семейство COUP-TF 62
2.7.9. Основные этапы формирования печени 64
2.7.10. Спектры экспрессии ГЯФ в печени и других органах 67
2.7.11. Регуляционная иерархия ГЯФ. 69
2.7.12. ГЯФ в генетических заболеваниях человека 75
2.7.13. ГЯФ при вирусных инфекциях 75
2.7.14. ГЯФ при канцерогенезе 76
2.8. Регуляция экспрессии гена афп 77
2.8.1. Структура гена АФП и продукты его транскрипции 79
2.8.2. Синтез АФП в норме и при патологии 81
2.8.3. Механизмы регуляции экспрессии гена АФП 82
2.8.4. Регуляторные цис-элементы гена АФП 83
2.8.5. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции экспрессии гена АФП 85
2.8.6. Возможная модель регуляции гена АФП. 93
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Список использованных растворов и сред 96
3.2. Линии перевиваемых гепатокарцином 97
3.3. Клеточные линии 97
3.4. Трансформация клеток е. Coli 99
3.5. Выделение нуклеиновых кислот 99
3.6. Электрофорез нуклеиновых кислот
В неденатурирующих агарозных гелях 100
3.7. Метод "обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция" (от-пцр) 100
3.8. Нозерн-блот гибридизация 104
3.9. Определение активности теломеразы методом trap (telomerase repeat amplification protocol) 107
3.10. Авторадиография 108
3.11. Иммунохимическое выявление белков 108
3.12. Получение гистологических препаратов гк мышей 110
3.13. Гибридизация с кднк микрочипами 111
4. Результаты исследования 114
4.1. Изучение механизмов одноступенчатой прогрессии перевиваемых гк мышей 114
4.1.1. Сравнение биологических свойств бГКи мГК 114
4.1.2. Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК 117
4.1.3. Активация теломеразы при прогрессии ГК 120
4.1.4. Экспрессия гепато-специфических генов при прогрессии ГК. 122
4.1.5. Прогрессия ГК сопровождается подавлением экспрессии всехизоформ№Г4а
4.1.6. Гепатоцитарныеядерные факторы в прогрессии ГК 127
4.1.7. Восстановление экспрессии HNF4al в культуре клеток 6ГК ведет к восстановлению транскрипции некоторых гепато-специфических генов и установлению эпителиальной морфологии. 132
4.1.8. Регуляторныйрайон HNF4al в клетках 6ГКнеактивен. 137
4.2. Закономерности экспрессии гепато-специфических генов в гк мыши различного уровня дифференцировки 140
4.3. Изучение механизмов регуляции гена афп в клонах крысиной гепатомы 150
4.3.1. Различия в уровне синтеза АФП определяются на транскрипционном уровне. 150
4.3.2. Разработка нового метода трансфекции эукариотических клеток... 152
4.3.3. Анализ экспрессии репортерных генов под контролемрегуляторных элементов гена А ФП в А ФП+ и АФП- клонах. 153
4.3.4. Экспрессия гепато-специфических белков вАФП+ и АФП- клонах. 154
4.3.5. Сравнение спектров экспрессии транскрипционных факторов вАФП+ и АФП- клонах. 156
4.3.6. Получение соматических гибридов АФП+ и АФП- клонов 159
4.3.7. Синтеза АФП в полученных гибридах не наблюдается 161
4.3.8. Экспрессия генов семейства альбумина в соматических гибридах. 161
4.3.9. Закономерности экспрессии транскрипционных факторов в соматических гибридах. 163
4.3.10. Экзогенная экспрессия HNF4a и HNF1 вАФП- клонах крысиной гепатомы 164
4.4. Анализ спектров экспрессии генов в гк мышеи и крыс методом гибридизации с кднк микрочипами 169
4.4.1. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при прогрессии ГК 173
4.4.2. HNF4o.l-pecnoHcueHbie гены.. 175
4.4.3. Возможные маркеры гепатоканцерогенеза 175
4.4.4. Гены, дифференциально экспрессирующиеся в ГК мышей разного уровня дифференцировки и клонах крысиной гепатомы, различающихся по синтезу А ФП 178
4.5. Экспрессия hnf4al в образцах гк человека подавлена 180
5. Обсуждение 184
5.1. Изменения ткане-специфической экспрессии генов при прогрессии гк 184
5.1.1. Одноступенчатая прогрессия перевиваемых ГК мыши 184
5.1.2. Экспрессия транскрипционных факторов, определяющих гепатоцитарный фенотип, при прогрессии ГК 185
5.1.3. Экспрессия HNF4a при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей 186
5.1.4. HNF4al - важный регулятор дифференцировки гепатоцитов 187
5.1.5. Что стало причиной репрессии HNF4a? 192
5.2. Регуляция экспрессии гена афп 195
5.3. Изменения профилей экспрессии генов при прогрессии гк 200
Заключение 204
Выводы 206
