Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Структура и свойства Д-глицеральдегид-3-фосфатде- гидрогеназы 9
1.1. Строение молекулы ГАФД 9
1.2. Структура активного центра ГАФД 12
1.3. Кооперативные свойства ГАФД 15
1.4. "Полуцентровые" свойства ГАФД 16
1.5. Модели, объясняющие строение ГАФД 18
1.6. Значение димер-димерной организации ГАФД в процессе катализа 25
2. Применение конформационных зондов 30
2.1. Значение конформационных проб для исследования ферментов ".""." . ". 30
2.2. Применение флуоресцентных зондов для исследования ферментов . 31
2.3. Природа флуоресцентных зондов 37
2.4. Участки белков, связывающие зонды 38
2.5. Поляриметрические методы в исследованиях, связанных с применением конформационных зондов . 39
2.6. Флуоресцентные свойства аурамина 0 43
2.7. Аурамин 0 как конформационный зонд 46
2.8. Применение аурамина 0 для исследования алкоголь-дегидрогеназы /АДГ/ из печени 47
2.9. Применение аурамина 0 для исследования алкоголь-дегидрогеназы /АДТ/ из дрожжей 51
2.10.Взаимодействие алкогольдегидрогеназы с другими катионными зондами 52
2.II. Применение производных зтеноцитозина для исследования ГАЩЦ 57
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59
1. Использованные реактивы 59
2. Определение концентраций и приготовление растворов реактивов . 60
3. Выделение ГАЩЦ из пекарских дрожжей . 61
4. Выделение ГАЩЦ из скелетных мышц кролика . 63
5. Получение апофермента ГАЗЩ из мышц кролика 65
6. Определение концентрации белка в препаратах ГАЩЦ . 65
7. Определение энзиматической активности ГАЩЦ 66
8. Избирательная модификация SH-груіш. активных центров: фермента иодацетатом и иодацетамидом . 66
9. Флуориметрические исследования . 67
10. Титрование белка красителем 69
11. Титрование комплекса ГАЩЦ-аурамин 0 лигандами . 70
12. Спектрофотометрические измерения 70
13. Поляриметрические исследования 70
14. Исследования методом равновесного диализа 71
15. Седиментационный анализ 72
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 73
1. Флуоресценция аурамина 0, связанного с ГАЗЩ 73
2. Влияние рН среды на флуоресценцию связанного аурамина 0 76
3. Влияние ионов на связывание аурамина 0 с ГАФД . 79
4. Флуоримиетрическое титрование препаратов фермента аурамином 0 34
5. Исследование связывания флуоресцентного зонда дегидрогеназой методом равновесного диализа 87.
6. Связывание акридинового оранжевого с ГАЩЦ из пекарских дрожжей . 90
7. Влияние НДЦ на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАЩЦ , 97
8. Влияние НДЦН на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАЩ 105
9. Исследование связывания аурамина 0 с ГАЩ методом кругового дихроизма 109
10. Взаимодействие с ГАЩЦ никотинамидмононунлеотида III
11. Влияние аденинсодержащих фрагментов. НАД на связывание аурамина 0 с ГАЩЦ и на флуоресцентные характеристики зонда 118
12. Влияние субстрата и его аналогов на связывание аурамина 0 с ГАЩЦ и флуоресцентные характеристики зонда , 126
13. Изучение модифицированного фермента 133
13.1. Модификация фермента ДІНБ 133
13.2. Модификация фермента алкилирующими агентами . 142
14. Влияние аурамина 0 на реакцию, катализируемую ГАЩЦ 146
15. Изучение способности аурамина 0 связываться с субъединицами ГАЩЦ в различных функциональных состояниях 150
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 156
ВЫВОДЫ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
