Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Вирусные заболевания культивируемых видов рыб 11
2.1.1. Семейство Rhabdoviridae 11
2.1.1.1. Структура рабдовирусов 11
2.1.1.2. Особенности генома рабдовирусов рыб 13
2.1.2. Некоторые заболевания культивируемых видов рыб, вызываемые рабдовирусами 16
2.1.2.1 Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) 16
2.1.2.2. Вирусная геморрагическая септицимия (ВГС) 17
2.1.2.3. Весенняя виремия карпа (ВВК) 18
2.1.3 Методы профилактики и лечения вирусных заболеваний рыб 19
2.2. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб 21
2.2.1. Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре 21
2.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот 22
2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и молекулярно-генетический анализ - 25
2.2.3.1. Новейшие модификации метода ПЦР в диагностике вирусных инфекций рыб 31
2.2.3.1.1. Мультиплексная ПЦР 31
2.2.3.1.2 ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) 31
2.3. Генетическое типирование и филогенетический анализ рабдовирусов рыб 34
2.3.1. Вирус геморрагической септицимии 35
2.3.2. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани 42
2.3.3. Вирус весенней виремии карпа 49
2. 4. Заключение 51
3. Материалы и методы 54
3. 1. Материалы 54
3.2. Методы 59
3.2.1. Выделение вирусной РНК 59
3.2.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК 59
3.2.3. Амплификация фрагмента N-гена SVCV 59
3.2.4. Полимеразная цепная реакция на кДНК вируса IHN 60
3.2.5. Анализ первичной структуры ДНК 60
3.2.6. Выравнивание последовательностей фрагментов N-генов SVCV и IHNV и поиск сайтов рестрикции 61
3.2.7. Филогенетический анализ 61
3.2.8. Гидролиз фрагментов N-гена SVCV и IHNV эндонуклеазами рестрикции (ПДРФ-анализ) 61
3.2.9. Штамм-специфическое типирование SVCV
(ПЦР с праймерами Nros 11 Rev - Nros2) 62
3.2.10. Элюция из ПААГ фрагмента N-гена IHNV 62
3.2.11. Лигирование фрагмента N-гена IHNV с векторной ДНК 62
3.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. Coli и трансфекция рекомбинантным бактериофагом М13 63
3.2.13 Выделение RF-формы фаговой ДНК и анализ клонов 63
3.2.14. Выделение однонитевой ДНК фага М13 64
3.2.15. Мечение ДНК-зонда N-гидроксисукцинимидным эфиром биотина 65
3.2.16. Гибридизация вирусной РНК с биотинилированными ДНК-зондами 65
3.2.17. Выявление биотиновых групп на фильтрах 65
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Разработка методов выявления вируса весенней виремии карпа (SVCV) на основе полимеразной цепной реакции 67
4.1.1. Амплификация фрагментов генома SVCV 67
4.1.2. Определение специфичности и чувствительности выявления РНК SVCV методом ОТ-пгПЦР 68
4.1.3. Эффективность выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР в полевых материалах от рыб 70
4.1.4. Определение эффективности метода ОТ-пгПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб 73
4.1.5. Оценка эффективности выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации 77
4.2. Генетическое типирование изолятов SVCV 82
4.2.1. Разработка метода штамм-специфической ПЦР 82
4.2.2. Рестрикционный анализ фрагмента N-гена SVCV 83
4.2.3. Филогенетический анализ изолятов SVCV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента N-гена (405 пн) 91
4.2.4. Типирование вирусных штаммов в клинических материалах от рыб с помощью рестрикционного анализа ^ 95
4.3. Разработка методов выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) на основе гибридизационного анализа 97
4.3.1. Конструирование ДНК-зонда для IHNV на основе ДНК фага МІ3 97
4.3.2. Гибридизационный анализ 98
4.4. Разработка метода выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани с помощью ОТ-ПЦР 101
4.4.1. Амплификация фрагментов генома IHNV 101
4.4.2. Определение чувствительности и специфичности выявления РНК IHNV методом ОТ-пгПЦР 104
4.4.3. Определение эффективности метода ОТ-пг ПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб 104
4.4.4. Тестирование клинических материалов от естественно зараженных рыб 107
4.4.5. Оценка эффективности выявления вируса IHN методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации 108
4.5. Генетическое типирование изолятов IHNV 111
4.5.1. Генетическое типирование изолятов IHNV с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 111
4.5.2. Филогенетический анализ некоторых изолятов IHNV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента N-гена (460 пн) 117
5. Выводы 120
6. Список использованной литературы
