Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура и фолдинг белков: современные представления 9
1.2. Флуоресцентные белки 12
1.2.1. Спектральные свойства флуоресцентных белков 14
1.2.1.1. Флуоресцентные белки из класса Anthozoa 14
1.2.1.2. Флуоресцентные белки из других классов организмов 15
1.2.1.3. Aequorea GFP и его улучшенные варианты 16
1.2.1.4. Фотоактивируемые флуоресцентные белки 17
1.2.2. Структурные свойства флуоресцентных белков 19
1.2.2.1. Пространственная структура, топология и олигомеризация 19
1.2.2.2. Механизмы образования хромофора 21
1.2.2.3. Микроокружение хромофора 23
1.2.3. Конформационная стабильность флуоресцентных белков 25
1.3. Одорант-связывающие белки 26
1.3.1. Лиганды OBPs 27
1.3.2. Трехмерная структура OBPs 27
1.3.3. Комплексы OBPs с молекулами одорантов 30
1.3.4. Предположительная роль OBPs 32
1.3.5. Конформационная стабильность рОВР 34
ГЛАВА 2: Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.2. Методы 37
2.2.1. Анализ пространственной структуры белка 37
2.2.2. Флуоресцентные измерения 39
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции 40
2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма 40
2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации 41
2.2.6. Измерение кинетических кривых денатурации белков 42
2.1.1. Тушение флуоресценции акриламидом 42
2.2.1. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы 43
2.2.2. Расчет кинетических параметров 45
2.2.10. Расчет термодинамических параметров 45
ГЛАВА 3: Результаты и обсуждение 48
3.1. Особенности процессов денатурации egfp и его мутантных форм с заменами в положении 96 49
3.1.1. Экспрессия EGFP и его мутантных форм в бактериальных клетках 49
3.1.2. Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм 49
3.1.3. Влияние точечных аминокислотных замен в положении 96 на структуру EGFP..50
3.1.4. Особенности денатурации EGFP под действием GdnHCl. Влияние замен в положении 96 на стабильность EGFP 63
3.2. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков .71
3.2.1. Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs 72
3.2.2. Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков 72
3.2.3. Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя 75
3.2.4. Особенности триптофановой флуоресценции 75
3.2.5. Кинетика денатурации под действием гуанидингидрохлорида 79
3.2.6. Квазистационарные зависимости 83
3.3. Разворачивание-сворачивание овр под действием gdnhcl и нагревания 92
3.3.1. Локальные предденатурационные изменения структуры ОВР под действием небольших концентраций GdnHCl 104
3.3.2. Устойчивость структуры ОВР к денатурирующему действию GdnHCl 109
3.3.3. Тепловая денатурация ОВР 115
Выводы 120
Список цитируемой литературы
