Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. "Скрытый" метаболизм 11
1.1.1. Примеры реакций "скрытого" метаболизма И
1.1.2. Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина 14
1.1.3. Механизм токсического действия норлейцина 20
1.1.4. Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты 20
1.2. Пути метаболизма треонина в клетках . coli 22
1.2.1. Биосинтетическая треониндезаминаза 22
1.2.1. Аэробные пути деградации треонина 23
1.2.2. Анаэробный путь деградации треонина 27
1.2.3. Регуляция транскрипции tdcABCDEFG оперона 32
1.2.4. ТРР-зависимый путь деградации треонина 34
1.2.5. Метилцитратный цикл метаболизма пропионил-КоА 36
1.3. Синтазы ацетогидроксикислот в синтезе разветвленных аминокислот у Е. coli 39
1.3.1. Классификация синтаз ацетогидроксикислот и их метаболическая роль 39
1.3.2. Изоферменты AHAS у Е. coli 40
1.3.3. Субстратная специфичность и кинетические свойства AHAS 41
1.3.4. Регуляция экспрессии AHAS 42
1.3.4.1. Регуляция транскрипции ilvBN оперона 42
1.3.4.2. Регуляция транскрипции ilvGMEDA оперона 43
1.3.4.3. Регуляция транскрипции ilvIHоперона 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Среды, условия культивирования штаммов 47
2.2. Трансформация, трансдукция бактерий, интеграция экспрессионных кассет 47
2.3. Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК 48
2.4. Бактериальные штаммы, использованные в данной работе 49
2.5. Эксперименты с рекомбинантной ДНК 52
2.6. Конструирование рекомбинантных плазмид 54
2.7. Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ 60
2.8. Анализ деградации Ь-[Ц-14С]треонина в штамме ITP290-3 61
2.9. Получение Ь-13С-треонина 61
2.10. Регистрация и обработка ЯМР-спектров 62
2.11. Измерение энзиматических активностей 63
2.11.1. Определение активности треониндезаминазы 63
2.11.2. Определение активности ацетолактатсинтазы 64
2.11.3. Определение активности изопропилмалатсинтазы 64
2.12. Определение времени полужизни треониндезаминазы и AHAS 65
2.13. Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина 65
2.14. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот 66
2.15. Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli 67
2.16. Компьютерные программы, использованные в данной работе 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях
контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию 68
3.1.1. Конструирование модельного штамма ITP290-3 68
3.1.2. Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA е 70
3.1.3. Анализ продуктов деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3 72
3.1.4. Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии 74
3.2. Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат 81
3.2.1. Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме ITP290-3 81
3.2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP290-3 83
3.2.3. Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле.85
3.3. Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот 85
3.3.1. Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона 86
3.3.2. Клонирование генов валин-чувствительных AHAS I и AHAS III 88
3.3.3. Клонирование генов AHAS I в составе оперона ТА-\Х-(ЬгА442В 89
3.3.4. Клонирование генов AHAS из М. methylotrophus 90
3.4. Изучение сверхсинтеза норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма
Е. coli, дефектного по AHAS 93
3.4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH 93
3.4.2. Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина...96 3.4.3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина 97
3.4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IPMS 99
Выводы 104
Список использованной литературы
