Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Бесклеточные белоксинтезирующие системы 10
1.1.1. История создания 11
1.1.2. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции 12
1.1.3. Получение и состав 14
1.1.4. Энергетический обмен 15
1.1.5. Роль катионов 16
1.1.6. Различные типы систем 17
1.1.7. Реакторы для проведения биосинтеза белка 17
1.1.8. Получение "чистой" белоксинтезирующей системы 20
1.2. Технологии получения искусственных генов " " 22
1.2.1. Искусственные гены в современной молекулярной биологии 22
1.2.2. Метод Кораны - история синтез первого гена 24
1.2.3. Получение генов из частично комплементарных олигонуклеотидов 25
1.2.4. Стадии синтеза генов 27
1.2.5. Использование специализированных компьютерных программ 28
1.2.6. Развитие технологии синтеза олигонуклеотидов 29
1.2.7. Микросинтез олигонуклеотидов с использованием пико-чипов 32
1.2.8. Способы объединения олигонуклеотидов 33
1.2.8.1. Ферментативное объединение олигонуклеотидов 33
1.2.8.2. Попарное объединение дуплексов с использованием ДНК-лигазы 33
1.2.8.3. Синтез с помощью "якорных" и "линкерных" олигонуклеотидов 34
1.2.8.4. Множественное объединение олигонуклеотидов 37
1.2.8.4. "Серийное клонирование" 37
1.2.8.5. "Репаративная достройка" 38
1.2.8.6. Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР 39
1.2.8.7. Получение генов на микрочипах 40
1.2.9. Способы объединения синтетических сегментов 41
1.2.9.1. Объединение с помощью ПЦР 41
1.2.9.2. Объединение с помощью ДНК-лигазы 42
1.2.9.3. Использование эндонуклеаз рестрикции типа IIS 42
1.2.10. Способы коррекции ошибок 43
1.2.10.1. Применение эндонуклеаз, узнающих неспаренности цепей ДНК 43
1.2.10.2. "Фильтрация совпадений" 44
1.2.10.3. "Общее слияние" 44
1.2.10.4. Гибридизация с" селекционными олигонуклеотидам 45
1.2.11. Синтез вирусных геномов и мегакластеров генов 45
1.2.12. Синтез генома микроорганизма * 46
1.2.13. Другие проекты по синтезу геномов 47
1.2.14. Этические проблемы получения искусственного организма 50 1.3. Объект исследования - плацентарный ингибитор рибонуклеаз 51
2. Экспериментальная часть 56
2.1. Материалы и оборудование 5 6
2.2. Методы 66
2.2.1. Модификация нуклеотидной последовательности гена ИР 66
2.2.2. Условия ПЦР амплификации ДНК 66
2.2.3. Химико-ферментативный синтез ДНК 67
2.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов с помощью ПЦР 68
2.2.5. Удаление мутаций с использованием ПЦР 69
2.2.6. Очистка ДНК с помощью препаративного электрофореза 69
2.2.7. Ферментативные реакции и их детектирование 70
2.2.8. Обработка препаратов Т5 ДНК-нуклеазой 70
2.2.9. Получение генетических конструкций 70
2.2.9.1. Клонирование синтетических сегментов гена ИР 71
2.2.9.2. Получение генетической конструкции pRI 71
2.2.9.3. Получение генетических конструкций pRI-His и pRI-Nus 72
2.2.9.4. Получение генетических конструкций pET-RN и pET-ANG 72
2.2.9.5. Получение генетических конструкций pRI-RN и pRI-ANG 72
2.2.10. Получение компетентных клеток E.coli 73
2.2.11. Трансформация компетентных клеток Е.coli 1Ъ
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 74
2.2.13. Получение S30 экстракта Е.coli 75
2.2.14. Транскрипция РНК in vitro 75
2.2.15. Выделение тотальной РНК Е. coli 75
2.2.17. Экспрессия рекомбинантных генов в E.coli 76
2.2.17.1. Аналитическая экспрессия 76
2.2.17.2. Препаративная экспрессия 76
2.2.17.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов 77
2.2.18. Синтез белков в БСТТ на основе Е. coli 77
2.2.18.1. БСТТ в формате "batch" 77
2.2.18.2. Диализная БСТТ открытого типа 78
2.2.19. Выделение ИР из телец включения 78
2.2.19.1. Выделение ИР растворением в 8 М мочевине 78
2.2.19.2. Хроматографическая очистка ИР в денатурирующих условиях 79
2.2.19.3. рН-зависимая ренатурация ИР 79
2.2.20. Выделение ИР из клеточного экстракта E.coli 80
2.2.21. Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот 81
2.2.22. Определение концентрации общего белка 81
2.2.23. Определение концентрации GFP по интенсивности флюоресценции 81
2.2.24. Электрофоретический анализ белков 82
2.2.25. Точное определение активности ИР 82
2.2.26. Оценка активности ИР с помощью электрофореза 83
2.2.27. Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ 84
3.1. Оптимизация кодонового состава гена ИР 84
3.2. Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы 86
3.3. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК 90
3.4. Исправление мутаций 97
3.5. Корректирование и клонирование синтетических ДНК 100
3.6. Получение полноразмерного гена ИР 101
3.7. Экспрессия гена ИР в Е. coli 103
3.7.1. Экспрессия гена ИР в составе pRI в Е. coli 103
3.7.2. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов 105
3.7.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами рибонуклеазы А и ангиогенина 106
3.8. Выделение ИР 107
3.8.1. Выделение ИР из телец включения 107
3.8.2. Разработка схемы очистки ИР из клеточного экстракта 108
3.9. Определение активности ИР 110
ЗЛО. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе Е.coli 112
3.11. Получение БСТТ с использованием гена ИР 114
Заключение 119
Выводы 120
Список публикаций, выполненных по теме диссертации 121
Список литературы
