Введение
1. Обзор литературных данных 8
1.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной 8
эктодермы.
111. Дифференцировка нервной пластинки. 10
1.1.2. Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы . 11
1.1.3 Дифференцировка области нервного гребня. 14
1.2. Гомеодоменный транскрипционный фактор Anf - регулятор 16
раннего развития переднего мозга позвоночных
1.3 Генетические мишени гомеодоменного транскрипционного 18
фактора Xanfl.
1.4 ГТФ-связывающие белки 19
1.5 Суперсемейство малых ГТФаз 20
1.5.1 Основные характеристики и свойства малых ГТФаз. 23
1.5 Л. 1 Цикл активации/инактивации малых ГТФаз 24
1.5.1.2 Строение и функция каталитического G-домена 25
1.5.1.2.1 Связывание ГТФ 26
1.5.1.2.2 Гидролиз ГТФ и вспомогательные GAP белки 27
1.5.1.3 Внутриклеточная локализация малых ГТФаз 28
1.5.2 Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе . 31
1.5.2.1 Ras семейство малых ГТФаз 31
1.5.2.2 Rho семейство малых ГТФаз 3 5
1.5.2.3 Rab семейство малых ГТФаз 39
1.5.2.4 Arf7 Sari семейство малых ГТФаз 40
1.5.2.5 Ran семейство малых ГТФаз 42
1.5.2.6 RGK семейство малых ГТФаз. 43
1.5.2.7 RJL семейство малых ГТФаз. 44
1.5.2.8 Gie семейство малых ГТФаз. 45
1.6 Заключение 46
2. Результаты и их обсуждение 47
2.1 Выяснение систематического положения новой малой ГТФазы 47 Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз
2.1.1. Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей .
2.L2. Филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз с 51
новыми белками Ras-dva
2.1.3. Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных 52
последовательностей G-домена белков Ras-dva и других малых
ГТФаз. 2.2. Изучение функциональной роли малой ГТФазы Ras-dva в 54 процессах раннего эмбрионального развития на модели зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.
2.2.1. Изучение внутриклеточной локализации белка Ras-dva. 54
2.2.2. Динамика экспрессии гена Ras-dva в эмбриогенезе 59
шпорцевой лягушки.
2.2.3. Регуляция начальных этапов экспрессии гена Ras-dva. 63
2.2.4. Морфологические аномалии развития, возникающие при нарушении функционирования гена Ras-dva на ранних этапах развития, и подтверждение их специфичности.
2.2.5. Влияние ингибирования работы гена или белка Ras-dva на экспрессию специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей шпорцевой лягушки.
2.2.6. Поиск специфического сигнального каскада, в котором 80
может принимать участие малая ГТФаза Ras-dva на ранних этапах развития зародышей шпорцевой лягушки.
3. Выводы 34
4. Материалы и методы 85
4.1. Материалы. 85
4.1.1. Реактивы. 85
4.1.2. Ферменты 86
4.1.3. Лабораторное оборудование. 86
4.1.4. Лабораторные животные. 86
4.1.5. Буферы и растворы. 87
4.1.6. Миробиологические среды. 88
4.1.7. Предоставленные плазмидные конструкции. 88
4.1.8. Предоставленные dig-зонды. 89
4.2. Методы исследования. 89
4.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР).
4.2.2. Изготовление ДНК конструкций. 89
4.2.2.1. Клонирование гена шпорцевой лягушки FgfSa. 89
4.2.2.2. ПЦР-мутагенез. Создание генов, кодирующих мутантные варианты белков Ras-dva и K-Ras.
4.2.3. Транскрипция in vitro. 92
4.2.4. Получение зародышей шпорцевой лягушки. Микроинъекции.
4.2.5. Блокирование эндогенной мРНК Ras-dva при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых морфолино олигонуклеотидов или олигонуклеотидов на основе гидроксипролина.
4.2.5.1. Морфолино олигонуклеотиды. 93
4.2.5.2 Аналоги пептид-нуклеиновых кислот (PNA): отрицательно заряженные PNA-подобные ДНК миметики.
4.2.6. Фиксация зародышей шпорцевой лягушки. 95
4.2.7. Гибридизация In situ 96
4.2.8. Синтез dig-меченой анти-смысловой РНК для приготовления гибридизационой пробы.
4.2.9. Парафиновые срезы фиксированных препаратов. 99
4.2.10 Экстракция тотальной РНК из эксплантатов анимальной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки. Обратная
транскрипция и полимерразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).
4.2.11. Трансфекция клеток линии мышиных фибробластов NIH-3T3 105
Благодарности. 107
Список сокращений. 108
Список литературы. 109
