Введение
Глава 1. Введение
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна и практическая ценность работы 9
1.4. Апробация работы 9
1.5. Структура и объем работы 10
1.6. Публикации 10
1.7. Вклад автора 11
1.8. Благодарности 11
1.9. Список использованных сокращений 12
Глава 2. Обзор литературы
2.1. Онкогенез и тумор-супрессоры 13
2.2. Нейрофиброматоз 2 типа 14
2.3. Характеристика белкового семейства ERM
2.3.1. Функциональная организация 15
2.3.2. Регуляция активности ERM белков 18
2.4. MERLIN - особый член семейства ERM 19
2.4.1. Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования 20
2.4.2. Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками 21
2.4.3. Модельные организмы для изучения белка мерлин 22
2.4.4. Локализация белка мерлин в органах и тканях 23
2.4.5. Гомология дрозофилиного и человеческого мерлина 24
2.4.6. Участие белка мерлин в сигнальных путях и его тумор-супрессорные свойства 25
2.4.7. Характеристика мутаций гена Merlin у дрозофилы 27
2.4.8. Функциональные домены белка мерлин, необходимые
для его активности и правильной внутриклеточной локализации 28
2.4.8.1. Внутриклеточая локализация усеченных форм мерлина 29
2.4.8.2. Способность усеченных форм мерлина спасать летальный эффект мутации Мег4 30
2.4.8.3. Фенотипы, наблюдаемые при сверхэкспрессии 30 усеченных и мутантных форм мерлина
2.5. Основные этапы сперматогенеза у дрозофилы 32
2.6. Использование системы GAL4-UAS для изучения функций продуктов генов 38 Заключение по обзору литературы: 42
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними 43
3.2. Выделение геномной ДІЖ дрозофилы 44
3.3. Проведение полимеразной цепной реакции 44
3.4. Очистка продуктов ПЦР 46
3.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и ее очистка 46
3.6. Трансформация E.coli плазмидной ДНК 47
3.7. Выделение плазмидной ДНК 48
3.8. Лигирование ДНК 48
3.9. Трансформация компетентных клеток E.coli лигазной смесью 49
3.10. Отбор клонов, содержащих плазмиду со встройкой гена, кодирующего мутантную форму белка мерлин 49
3.11. Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из клонов E.coli после трансформации лигазной смесью 50
3.12. Определение нуклеотидной последовательности полученных конструкций 50
3.13. Трансформация клеток зародышевого пути D. melanogaster 51
3.14. Иммуноцитохимическое окрашивание крыловых имагинальных дисков и семенников 52
3.15. Окраска семенников DAPI 5 3
3.16. Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen) 53
3.17. Окраска семенников ацетоорсеином 54
Глава 4. Результаты
4.1. Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin 56
4.2. Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы 59
4.3. Нарушение поляризации цист у мутантов Мег3 и Мег4 60
4.4. Электронномикроскопические исследования семенников 65
4.5. Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp 61
4.5.1. Анализ эктопической экспрессии мутантных вариантов белка мерлин в соматической ткани 68
4.5.2. Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin 69
4.6. Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по гену Merlin 71
4.7. Эктопическая экспрессия усеченных копий гена Merlin в сперматогенезе на фоне нормального белка мерлин 77
4.7.1. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer+ и UASp-inycMer345635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 79
4.7.2. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer3, UASp-mycMer*83 и UASp-mycMer1379 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 82
Глава 5. Обсуждение
5.1. Восстановление жизнеспособности мутации Мег4 в соматической ткани 86
5.2. Отличие усеченной формы мерлина mycMer1"330 от mycMer1"
5.3. Восстановление сперматогенеза у самцов Мег4 при
эктопической экспрессии различных форм мерлина 88
5.4. Роль белка мерлин в соматической и генеративной тканях 89
5.5. Значение С-концевого домена мерлина в сперматогенезе дрозофилы 91
5.6. Значение мерлина в стабилизации структуры небенкерна 92
5.7. Участие мерлина в цитокинезе 95
5.8. Сравнительный анализ нарушений, вызванных мутациями гена Merlin, и нарушений, возникающих в результате эктопической экспрессии 98
5.9. Внутриклеточная локализация мерлина 99
Заключение 101
Выводы 107
Список цитированной литературы
