Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Семейство полимедных оксидаз в лигнинмодифицирующем комплексе грибов белой гнили 13
1.1.1. Структура семейства полимедных оксидаз базидиомицетов... 14
1.1.2. Генетическая организация базидиальных лакказ 18
1.1.3. Регуляция синтеза лакказ 24
1.2. Синтез ипроцессинг секретируемых лакказ 27
1.2.1. Системы секреции мицелиальных грибов 28
1.2.2. Формирование пространственной конформации лакказ и
В страивание ионов меди 32
1.2.3. Посттрансляционные модификации лакказ 34
1.3. Роль базидиальных лакказ в процессах лигнино лиз а и
Жизнедеятельности грибов 37
1.3.1. Характеристика базидиальных грибов рода trametes 37
1.3.2. Общая характеристика структурных и каталитических свойств лакказ базидиальных грибов 39
1.3.3. Связь физиологической роли и биохимических функций лакказ, кодируемых мультигенным семейством 41
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Штамм микроорганизма (объект исследования) 45
2.2. Реагенты 45
2.3. Культивирование базидиомицета т. Hirsuta на средах различного Состава 46
2.3.1. Прекультивиров ание микроорганизма 46
2.3.2. Жидкофазное культивирование на синтетических средах
2.3.3. Жидкофазное культивирование на лигноцеллюлозном субстрате 47
2.3.4. Изучение динамики биомассы в процессе культивирования Т.hirsuta 47
2.4. Исследование секретома т. Hirsuta 47
2.4.1. Изучение динамики активностей ферментов лигнинмодифицирующего комплекса t.hirsuta 47
2.4.2. Оптимизация условий пробоподготовки образцов внеклеточных белков для протеомных исследовании
2.4.3. Двумерный электрофорез (2-de) белков 50
2.4.4. Масс-спектрометрическая идентификация белков 50
2.5. Исследование протеома т. Hirsuta 51
2.5.1. Оптимизация условий пробоподготовки образцов внутриклеточных белков для протеомных исследовании 51
2.6. Исследование транскриптома т. Hirsuta 52
2.6.1. Выделение нуклеиновых кислот (суммарной рнк) 52
2.6.2. Синтез первой цепи комплементарной днк (кднк) на рнк-матрице 52
2.6.3. Вычитание библиотек кднк
2.6.4. Зеркально-ориентированная селекция образцов кднк 55
2.6.5. Высокопроизводительное секвенирование образцов 57
2.6.6. Анализ результатов супрессионной вычитающей гибридизации Кднк 57
2.6.7. Дизайн праимеров дляпцр 57
2.6.8. Проведение полуколичественной гщр 59
2.6.9. Получение полноразмерных последовательностей генов лаккa Т.hirsuta 59
2.6.10. Проведение гщр в реальном времени 60
2.6.11. Биоинформатическии анализ последовательностей лакк a3 61
Глава 3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Изучение профилей внеклеточных белков т. Hirsuta
Продуцируемых базидиомицетом на средах различного состава
3.1.2. Оптимизация пробоподготовки внеклеточных белков т. Hirsuta для исследования секретома 66
3.1.3. Сравнительный анализ профилей внеклеточных белков, продуцируемых т. Hirsuta при культивировании на средах различного состава 69
3.2. Изучение профилей протеома т. Hirsuta, изменяющихся в ответ на индукцию лакказ медью и при росте на лигноцеллюлозном субстрате 79
3.2.1. Оптимизация пробоподготовки мицелия т. Hirsuta для исследования протеома 80
3.2.2. Сравнительный анализ профилей внутриклеточных белков т. Hirsuta при культивировании на средах различного состава 81
3.3. Сравнительный анализ данных тотальных транскриптомов в ответ на внесение ионов меди 88
3.3.1. Супрессионная вычитающая гибридизация для исследования мультигенного семейства лаккa3 т. Hirsuta 89
3.3.2. Секвенирование библиотек кднк и сборка транскриптомов 92
3.3.3. Анализ результатов ssh с помощью по blast то go 93
3.4. Исследование мультигенного семейства лакказ т. Hirsuta 100
3.4.1. In silico скрининг генов лакказ в транскриптоме 100
3.4.2. Анализ последовательностей членов мультигенного семейства лакказ trametes hirsuta 103
3.4.3. Кластеризация генов семейства лакказ т. Hirsuta и других грибов рода trametes 104
3.4.4. Изучение динамики экспрессии индивидуальных лакказ при культивировании на средах различного состава 111
3.4.5. Влияние эффекторов на профили экспрессии генов лакказ т. Hirsuta 113
Заключение 121
Список цитируемой литературы 125
