Введение
1.1. Фосфатазы 11
1.2. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз 12
1.3. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз 15
1.4. Физико-химические и каталитические характеристики щелочных фосфатаз и их пространстфенная организация
1.4.1. Молекулярная масса (Mr) и изоэлектрическая точка (pI) 19
1.4.2. Влияние значений рН и температуры 21
1.4.3. Влияние ингибиторов 29
1.4.4. Субстратная специфичность
1.5. Структурно-функциональные особенности щелочных фосфатаз 33
1.6. Структурно-функциональные особенности психрофильных щелочных фосфатаз морских бактерий 38
1.7. Практическое применение щелочных фосфатаз 42
2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Реагенты и материалы, использованные в работе 46
2.2. Выделение геномной ДНК 47
2.3. Гель-электрофорез ДНК 47
2.4. Амплификация структурных генов белков 48
2.5. Рестрикция 49
2.6. Лигирование фрагментов ДНК в плазмиду 50
2.7. Подготовка компетентных клеток и трансформация E.coli 51
2.8. Выделение и секвенирование рекомбинантных плазмид 52
2.9. Получение мутантных генов
2.10. Гетерологическая экспрессия рекомбинантных генов в E. coli 54
2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков 55
2.12. Анализ белковой фракции телец включения 56
2.13. Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле 56
2.14. Определение концентрации белков 57
2.15. Определение активности ЩФ 57
2.16. Определение активности лектинов 58
2.17. Определение активности силикатеиноподобного катепсина и анализ наноструктур 60
2.18. Определение каталитических параметров CmAP 60
2.19. Определение pH-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность CmAP 61
2.20. Определение температурного оптимума и температурной стабильности, влияния ионов магния на температурную стабильность CmAP 62
2.21. Влияние ионов натрия и калия на активность CmAP 62
2.22. Изучение влияния ЭДТА и ДСН на активность и стабильность CmAP 63
2.23. Субстратная специфичность щелочной фосфатазы 63
2.24. Статистика 63
2.25. Атомно-адсорбционная спектроскопия 64
2.26. 3D-Компьютерное моделирование пространственной структуры и молекулярный докинг 64
3. Результаты и обсуждения 66
3.1. Получение рекомбинантной щелочной фосфатазы CmAP 66
3.1.1. Получение плазмидных конструкций 66
3.1.2. Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии CmAP 70
3.1.3. Выделение и очистка рекомбинантной CmAP 73
3.2. Физико-химические свойства CmAP 75
3.2.1. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка 75
3.2.2. Оптимум рН, термостабильность и зависимость активности CmAP от присутствия ионов 77
3.2.3. Влияние ингибиторов 85
3.2.4. Субстратная специфичность
3.3. Каталитические параметры CmAP 90
3.4. Моделирование пространственной структуры CmAP 92
3.5. Сайт-направленный мутагенез CmAP 104
3.6. Перспективы применения рекомбинантной CmAP
3.6.1. Применение CmAP для дефосфорилирования векторов 109
3.6.2. Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина CmAP/LoC 111
3.6.3. Получение гибридных бифункциональных белков на основе генов CmAP и лектинов 1 3.6.3.1. Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего лектина CmAP/CGL 118
3.6.3.2. Моделирование пространственной структуры гибрида CmAP/CGL 123
3.6.3.3. Получение гибридного бифункционального маннан-связывающего лектина CmAP/MBL-AJ 125
3.6.3.4. Моделирование пространственной структуры маннан-связывающего лектина и его гибридного аналога CmAP/MBL-AJ 130 3.6.3.5. Молекулярный докинг in silico и мутагенез лектина в гибридном
бифункциональном белке CmAP/MBL-AJ 136
Выводы
Список литературы 145
