Введение
Обзор литературы 9
1. Структура Na,K-ATPазы. Изоформы - и -субъединиц 9
2. Механизм гидролиза АТР и транспорта ионов Na,K-ATPазой 16
3. Катионсвязывающие центры Na,K-ATPазы 18
4. Регуляция активности Na,K-ATPазы 19
5. Олигомеризация Na,K-ATPазы 21
6. Конформационные изменения Na,K-ATPазы 22
7. Na,K-ATPаза – рецептор кардиотонических стероидов 24
8. Связывание Na,K-ATPазы с кардиотоническими стероидами 27
9. Биосинтез кардиотонических стероидов 10. Токсический эффект кардиотонических стероидов 35
Физиологические эффекты кардиотонических стероидов 37
Цель и задачи исследования 41
Материалы и методы 42
1. Материалы 42
2. Методы
2.1. Получение фракции микросом из солевых желез утки 42
2.2. Очистка Na,K-ATPазы из микросом солевых желез уток 43
2.3. Определение концентрации белка 44
2.4. Определение активности Na,K-ATPазы 44
2.4.1. Определение активности Na,K-ATPазы по накоплению Pi 44
2.4.2. Определение активности с использованием системы сопряженных ферментов 45
2.5. Исследование ингибирования Na,K-ATPазы под действием КТС и расчет IC50 46
2.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле 47
2.7. Вестерн-блоттинг 47
2.8. Методы регистрации конформационных изменений, индуцированных
связыванием Na,K-ATPазы с кардиотоническими стероидами 48
2.8.1. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Na,K ATPазы из солевых желез утки 49
2.8.2. Включение 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ) в препараты Na,K-ATPазы, полученные из солевых желез утки 50
2.8.3. Измерение флуоресценции ФИТЦ- и 5-ИАФ-меченных препаратов Na,K-ATPазы, полученных из солевых желез утки 50
2.8.4. Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования 51
Устройство прибора VP-ITC Micro Calorimeter. 51
Изотермическая калориметрия титрования 54
2.9. Молекулярное моделирование 55
Результаты и их обсуждение 57
1. Характеристика препаратов Na,K-ATPазы, полученных из солевых желез утки 57
2. Ингибирование Na,K-ATPазы уабаином и маринобуфагенином 61
3. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток 64
4. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования 69
5. Моделирование участка -субъединицы Na,K-ATPазы, связанного с молекулой маринобуфагенина 75
6. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с AMP, ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования 78
7. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином в присутствии ADP и ATP методом изотермической калориметрии титрования 86
Заключение 89
Выводы 93
Список цитируемой литературы 94
