Введение
ГЛАВА 1. Вклад поверхностных аминокислотных остатков в стабильность белка 6
1.1. Взаимодействия поверхностных аминокислотных остатков, важные для стабильности белка
1.2. Поверхностные остатки и образование вторичной структуры 9
1.3. Аминокислотные замены в петлях и поворотах основной цепочки 12
1.4. Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые мостики 15
1.5. Гидрофобные остатки на белковой поверхности и обратный гидрофобный эффект 19
ГЛАВА 2. Поверхностные аминокислотные остатки и фолдинг белков 23
2.1. Сопряжение связывания и сворачивания для неструктурированных белков 23
2.2. Влияние антител на сворачивание 28
ГЛАВА 3. Молекулярные свойства экспериментальных объектов - убиквитина и пероксидазы хрена 33
3.1. Термодинамическая стабильность и фолдинг убиквитина 33
3.2. Фолдинг пероксидазы хрена 36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 41
4.1. Материалы 41
4.2. Методы 42
4.2.1. Мутагенез и экспрессия мутантных вариантов убиквитина 42
4.2.2. Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии 43
4.2.3 Измерение спектров кругового дихроизма (КД) 45
4.2.4 Получение и очистка моиоклональных антител против пероксидазы хрена... 45
4.2.5 Денатурация и ренатурация пероксидазы хрена 46
4.2.6 Измерение каталитической активности пероксидазы 46
4.2.7 Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ 47
4.2.8 Титрование апо-пероксидазы хрена гемом 47
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 49
ГЛАВА 5. Эффект аминокислотных замен на поверхности убиквитина на стабильность белка 49
5.1. Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина 49
5.2. Вклад разной способности аминокислот образовывать а-спираль в стабильность убиквитина 55
5.3. Гидрофобные взаимодействия на частично экспонированных позициях на поверхности убиквитина 60
ГЛАВА 6. Влияние антител на сворачивание пероксидазы хрена 74
6.1 Сворачивание пероксидазы хрена в присутствии моноклональных антител... 74
6.2 Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы при ренатурации 82
6.3 Возможный механизм увеличения выхода ренатурации пероксидазы в присутствии антител 90
Выводы 92
Список литературы 94
