Введение
2. ДНК-метилтрансферазы бактериальных систем рестрикции-модификации (обзор литературы) 8
2.1. Распространение систем рестрикции-модификации и днк-метилтрансфераз в природе 8
2.2. Классификация рм систем 11
2.2.1. РМ системы I типа 11
2.2.2. РМ системы II типа 12
2.2.3. РМ системы III типа 17
2.2.4. РМ системы IV типа 18
2.2.5. Одиночные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции 18
2.3. Функции ферментов бактериальных рм систем 19
2.3.1. Обеспечение защитной функции. Рестрикция и антирестрикция 19
2.3.2. Участие ДНК-метилтрансфераз в репарации и репликации 20
2.3.3. Другие функции 21
2.4. Опероны рм систем 22
2.4.1. Расположение генов в оперонах РМ систем 22
2.4.2. Регуляция активности ферментов РМ систем II типа С-белками 25
2.5. Классификация и структура днк-метилтрансфераз 28
2.5.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз 28
2.5.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз 32
2.5.2.1. AdoMet-связывающий домен 32
2.5.2.2. Каталитический домен 36
2.5.2.3. TRD- домен 37
2.6. Специфичность днк-метилтрансфераз 39
2.6.1. Модификация неканонических сайтов ДНК-метилтрансферазами 40
2.6.2. Метилирование ДНК-метилтрансферазами одноцепочечных субстратов 43
2.6.3. Оптимальные условия функционирования ДНК-метилтрансфераз 44
2.7. Механизмы реакций метилирования ДНК 45
2.7.1. Метилирование экзоциклических аминогрупп аденина и цитозина 45
2.7.2. Метилирование эндоциклического С5 атома цитозина 48
2.7.,3. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз 49
3. Материалы и методы 57
3.1. Материалы 57
3.2. Методы 57
3.2.1. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 57
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 58
3.2.3. Метод селективной супрессии полимеразной цепной реакции 58
3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей 61
3.2.5. Определение оптимальных условий метилирования ДНК-субстратов метилтрансферазами РМ системы Bst5l 62
3.2.6. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами 62
3.2.7. Компьютерный анализ последовательностей ДНК и белков 63
4. Результаты и обсуждение 65
4.1. Определение полной нуклеотиднои последовательности оперона рм системы 55/F51 65
4.1.1. Клонирование гена &y/F5IM-3 65
4.1.2. Определение четвертой открытой рамки трансляции 66
4.1.3. Клонирование гена fo/F5IM-4 68
4.1.4. Клонирование гена &sfF5IR 69
4.1.5. Расположение генов в опероне РМ системы Bst на секвенированном участке бактериальной хромосомы 72
4.2. Экспрессия генов днк-метилтрансфераз рм системы bstfsl в клетках E.coli 73
4.3. Анализ первичных структур ДНК-метилтрансфераз 77
4.3.1. ДНК-метилтрансфераза M.i?s/F5I-3 77
4.3.2. ДНК-метилтрансфераза M.BstY5\A 79
4.4. Изучение биохимических свойств днк-метилтрансфераз 82
4.4.1. Определение цепи, модифицируемой M..5.S/F5I-3 82
4.4.2. Определение цепи, модифицируемой Ni.Bst5\-2 и M.#s*F5I-4 83
4.4.3. Сравнение субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз 85
4.4.4. Зависимость активности ферментов от температуры 86
4.4.5. Зависимость активности ферментов от величины рН 86
4.4.6. Зависимость активности ферментов от концентраций ионов Na+ и К+ 90
4.5. Кинетические характеристики днк-метилтрансфераз 92
4.5.1. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на полимерной ДНК 92
4.5.2. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах 95
4.5.3. Сравнение кинетических характеристик гомологичных ДНК-метилтрансфераз РМ систем Bst5l и Fokl 98
Выводы 103
Список литературы 104
