Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Роль протеолитических ферментов в функционировании организма 13
1.2. Ферменты семейства неприлизина 14
1.3. Неприлизин. Свойства и функции 16
1.4. Образование амилоидного пептида (АР) 22
1.5. Свойства амилоидного пептида 26
1.5.1. Выведение Ар из организма и мозга 28
1.6. Регуляция экспрессии неприлизина
1.6.1. Регуляция экспрессии неприлизина внутриклеточным фрагментом белка предшественника амилоидного пептида (AICD)
1.6.2. Альтернативные пути регуляция экспрессии неприлизина 32
1.6.3. Активность каспаз при действии патологических факторов 33
1.6.4. Гипоксия, как фактор, влияющий на изменение экспрессии и активности неприлизина
1.7. Мягкое когнитивное снижение и болезнь Альцгеймера 37
1.8. Поиск маркеров для ранней диагностики болезни Альцгеймера
1.9 Заключение 44
2. Материалы и методы 45
2.1. Экспериментальные животные 45
2.2. Модель пренатальной гипоксии 46
2.3. Анализ кратковременной памяти 46
2.4. Оценка кратковременной и долговременной памяти в модифицированном тесте «распознавание новых объектов»
2.5. Введение ингибиторов каспаз в желудочки мозга крыс 47
2.6. Внутрибрюшинные введения крысам вальпроата натрия 48
2.7. Выделение мембраносвязанных фракций белков из структур мозга крыс
2.8. Получение плазмы крови крыс 49
2.9. Культура клеток нейробластомы человека NB7
10. Культивирование клеток нейробластомы человека NB7 в 50 гипоксических условиях
11. Экстракция мРНК 50
12. Количественное определение РНК 50
13. Флуоресцентный метод определения активности неприлизина 50
14. Определения уровня связывания AICD с промотором гена НЕП при помощи метода иммунопреципитации хроматина
15. ПНР в реальном времени 52
16. Определение концентрации белка 53
17. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ 54
18. Анализ белков с использованием иммуноблоттинга 54
19. Анализ экспрессии неприлизина методом иммуноцитохимии и флуоресцентной конфокальной микроскопии
20. Обследование пациентов для постановки диагноза МКС или болезнь Альцгеймера
21. Получение плазмы крови пациентов (R)
22. Применение лекарственного препарата Цераксон 57
23. Статистический анализ результатов 58
Результаты исследования 59
1. Изменение активности и экспрессии неприлизина в ткани мозга крыс в ходе нормального онтогенеза и после пренатальной гипоксии
1.1. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга интактных крыс
1.2. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию
1.3. Анализ экспрессии неприлизина в теменной коре мозга молодых и 63 взрослых интактных крыс
1.4. Влияние старения и пренатальной гипоксии на изменение процессов обучения и запоминания у крыс
2. Сравнительный анализ влияния пренатальной гипоксии на изменение активности и экспрессии неприлизина в теменной коре и гиппокампе взрослых крыс
3. Исследование механизмов регуляции неприлизина с использованием клеток нейробластомы человека NB7
3.3.1. Влияние гипоксии на уровень экспрессии и активности неприлизина в культуре клеток NB7
3.3.2. Эффект гипоксии на активность членов семейства каспаз 71
3.3.3. Изменение уровня связывания транскрипционного фактора AICD промотором гена НЕП при гипоксии
3.3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение активности неприлизина при гипоксии
3.3.5. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение уровня связывания AICD с промотором гена НЕП при гипоксии
3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина и содержание AICD при гипоксии in vivo
3.5. Эпигенетическая регуляция экспрессии неприлизина вальпроатом натрия in vivo
3.6. Влияние антиоксиданта эпигаллокатехин-3-галлата на активность неприлизина в ткани мозга крыс
3.7. Изменение активности неприлизина в плазме крови крыс в норме и после пренатальной гипоксии
3.8. Анализ активности неприлизина в плазме крови пациентов с мягким когнитивным снижением и БА
3.9. Влияние фармакологического агента Цераксона на изменение активности неприлизина и состояния пациентов
4. Обсуждение 95
5. Заключение 100
6. Выводы 102
Перечень сокращений 103
Список литературы 105
