Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Подходы к изучению и созданию устойчивости. Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам
1.1.1. Устойчивость, обусловленная встраиванием генов вирусного происхождения (pathogene-derived resistance)... 10
1.1.1.1 Устойчивость, детерминированная встраиванием гена белка оболочки вируса 11
1.1.1.2. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гена репликазы 12
1.1.1.3. Устойчивость, определяемая встраиванием гена транспортного белка 13
1.1.1.4. Введение в геном растений вирусных нуклеотидных последовательностей. 13
1.1.1.5. Проблемы, связанные с использованием PDR-трансгенов, и перспективные направления PDR-защиты растений 15
1.1.2. Устойчивость, основанная на использовании механизмов замолкания 20
1.1.3. Создание устойчивости с использованием генов растений 23
1.1.4. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гетерологичных, «экзотических» генов 25
1.1.4.1. Введение генов белков, инактивирующих рибосомы... 26
1.1.4.2. Введение генов нуклеаз 28
1.1.4.3. Использование генов иммунной системы животных. 29
1.1.4.3.а. Введение генов интерферонов 30
1.1.4.3.b Введение компонентов 2-5А системы 30
1.1.4.З.С. Введение генов, кодирущие антитела 32
1. 2. Двунитевая РНК в организме животных и растений 34
1.2.1. Важнейшие свойства PTGS 37
1.2.2. Общий механизм PTGS 37
1.2.3. РНК-зависимое метилирование ДНК и транскрипционное умолкание генов 43
1.2.4. Микро РНК (miRNA) растений 47
1.2,4,1. Происхождение и структура miRNA 47
1.2.4.2. Механизм действия и функции микроРНК 49
1.2.5. Генетический контроль процессов PTGS /РНК-интерференции и связанного с ними метилирования у растений „ 51
1.2.6. Проблемы неспецифичности действия дцРНК 55
Глава 2. Материалы и методы 58
2.1. Штаммы бактерий 58
2.2. Плазмиды 58
2.3. Растения , 58
2.4. Штаммы вируса табачной мозаики 58
2.5. Ростовые среды 58
2.6. Получение бинарного агробактериального вектора 59
2.7. Получение трансгенных растений 59
2.7.1. Трансформация табака 59
2.7.2. Процедура трансформации пшеницы 60
2.7.3. Отбор трансгенных растений табак, устойчивых к канамицину
2.7.4. Тестирование на устойчивость к канамицину потомства трансформантов пшеницы " *
2.8. Молекулярно-биохимические исследования 61
2.8.1. Выделение ДНК и РНК из растительных тканей 61
2.8.2. ПЦР 61
2.8.3. Саузерн и Нозерн гибридизация 63
2.9. Исследование растений на вирусоустойчивость 63
2.9.1. Процедура заражения 63
2.9.2. Оценка устойчивости 64
2.9.3. Экстракция белков листьев 64
2.9.4. Электрофорез растворимых белков листьев 64
2.10. Анализ белков 65
2.10.1. Гидролиз белка 65
2.10.2. ВЭЖХ триптических пептидов 65
2.10.3. Секвестрование пептидов 66
2.11. Статистическая обработка и компьютерный анализ 66
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака
3.1.1. Характеристика Т-ДНК экспрессионноговектора 67
3.1.2. Получение трансгенных растений табака 69
3.1.3. Наследование трансгенной вставки 72
3.2. Исследование вирусоустойчивости трансгенных растений табака 76
3.2.1. Изучение фитопатологических характеристик трансгенных растений 76
3.2.2. Изучение спектра растворимых белков 79
3.3. Исследование морфо физиологических характеристик трансформантов табака , 85
3.4. Трансформация пшеницы 90
3.4.1. Выделение трансформантов пшеницы 90
3.4.2. Наследование трансгенной вставки 93
3.4.3. Анализ на отсутствие агробактерий 95
3.4.4. Тестирование на устойчивость к канамицину 97
3.4.5. Эффективность трансформации пшеницы 98
3.4.6. Изменения признаков у трансформантов пшеницы Т2... 100
3.4.7. Наследуемость изменения признаков 100
Заключение 109
Выводы 113
Список литературы 115
