Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Явление рестрикции-модификации 9
1.2. Номенклатура и классификация ферментов систем рестрикции-модификации 10
1.3. Рестриктазы I типа 13
1.3.1. Специфичность ферментов I типа 13
1.3.2. Взаимодействие ферментов I типа с ДНК.... 14
1.4. Ферменты рестрикции-модификации Ш типа 16
1.4.1. Специфичность ферментов Ш типа 17
1.4.2. Механизм действия ферментов Ш типа 19
1.5. Рестриктазы П типа 20
1.5Л. Специфичность рестриктазы П типа 21
1.5.2. Свойства ферментов рестрикции П типа .... 28
1.5.3. Влияние условий культивирования и состава среды на содержание рестриктаз в биомассе...40
1.5.4. Выделение и очистка рестриктаз П типа ... 42
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Аппаратура 52
2.2. Материалы 52
2.3. Бактериальные штаммы и бактериофаг 53
2.4. Среды 53
2.5. Использованные в работе буферные растворы.. 53
2.6. Получение ДНК бактериофага 54
2.7. Выращивание и разрушение мицелия штамма s. albus G для выделения рестриктазы .... 55
2.8. Применение математических методов планирования экспериментов 56
2.9. Электрофорез ДНК 56
2.10. Определение активности рестриктазы Sal GI 5б
2.11. Определение концентрации белка 57
2.12. Приготовление 10% (об./об.) раствора полиэтиленимина 58
2.13. Подготовка сорбентов для колоночной хроматографии 58
2.14. Очистка рестриктазы Sal GI 58
2.15. Оценка неспецифических нуклеаз 59
2.16. Электрофорез белков 59
2.16.1. Электрофорез в денатурирующих условиях 59
2.16.2. Электрофорез нативных белков 60
2.17. Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации 60
2.18. Изоэлектрическое фокусирование 61
2.19. Определение оптимальных условий для эндонуклеазной реакции 62
2.20. Определение Km И Vmecc 62
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 64
3.1. Изучение условий культивирования 64
3.1.1. Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы Sal GI в биомассе. . 64
3.1.2. Оптимизация состава питательной среды математическими методами планирования эксперимента 65
3.2. Исследование условий осаждения ДНК 69
3.2.1. Фракционирование рестриктазы sal GI и белка стрептомицин-сульфатом 69
3.2.2. Фракционирование рестриктазы sal GI и белка полиэтиленимином 70
3.3. Исследование условия фракционирования сернокислым аммонием белка и рестрик
тазы Sal GI 70
3Л. Выделение и очистка рестриктазы Sal GI 73
3.4.1. Получение суспензии белков и фермента 73
3.4.2. Хроматография рестриктазы Sal GI на фосфоцеллюлозе РП 75
3.4.3. Хроматография рестриктазы sal GI на ДЭАЭ-трисакриле 75
3.4.4. Хроматография рестриктазы Sal GI
на гепаринсефарозе 77
3.4.5. Исследование чистоты ферментного препарата 81
3.4.5.1. Чистота препарата рестриктазы Sal GI 81
3.4.5.2. Определение электрофоретической гомогенности 81
3.5. Физико-химические и каталитические свойства рестриктазы Sai GI 83
3.5.1. Молекулярная масса 83
3.5.2. Определение изоэлектрической точки .. 86
3.5.3. Исследование влияния различных факторов на активность фермента 89
3.5.3.1. Изучение условий оптимальных для проявления активности рестриктазы
Sal GI 85
3.5.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость его расщепления рестрик-
тазой Sal GI 95
3.5.3.3. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы Sal GI 98
ВЫВОДЫ ЮЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
