Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1 Суперсемейство кадгеринов 12
1.2 "Классические" кадгерины. Структура кадгеринового комплекса 15
1.3 Кадгерины в клетках сосудов 21
1.4 Механизмы регуляции проницаемости эндотелия 24
1.5 Регуляция кадгерин-опосредуемои межклеточной адгезии путем фосфорилирования 27
1.6 Влияние кадгеринового комплекса на активацию внутриклеточных сигнальных путей 30
1.7 Т-кадгерин опосредует внутриклеточную сигнализацию 35
1.8 Роль Т-кадгерина в сосудистой системе в норме и при патологии 36
1.9 Т-кадгерин регулирует пролиферацию клеток и опухолевый рост 40
1.10 Т-кадгерин опосредует сигнальные эффекты ЛПН в клетках сосудов 44
ГЛАВА II. Материалы и методы 48
2.1 Материалы 48
2.2 Культивирование эукариотических клеток 48
2.3 Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов 49
2.4 Приготовление лизатов клеток 52
2.5 Определение концентрации белка в лизатах клеток 52
2.6 Электрофорез белков и иммуноблоттинг 52
2.7 Метод измерения активности SRE 53
2.8 Метод выделения активных Rho ГТФаз (GST-pull-down assay) 54
2.9 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток 55
2.10 Гиперэкспрессия Т-кадгерина в ЭК с использованием аденовирусной трансдукции 57
2.11 Подавление нативной экспрессии Т-кадгерина в ЭК методом siRNA с использованием лентивирусной трансдукции 57
2.12 Метод измерения проницаемости эндотелиального монослоя in vitro 58
2.13 Метод экстракции актина 59
2.14 Выделение и йодирование ЛНП 60
2.15 Определение поверхностного связывания І-ЛНП с клетками 61
2.16 Определение концентрации внутриклеточного Са 61
2.17 Миграция L929 клеток в микрокамере Бойдена 64
2.18 Статистическая обработка результатов 65
ГЛАВА III. Результаты 66
3.1 Т-кадгерин активирует Rho ГТФазы 66
3.2 Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42, но не влияет на активность RhoA - 68
3.3 Т-кадгерин увеличивает содержание фосфорилированной LIMK1 и влияет на организацию микротрубочек в ЭК 70
3.4 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина в ЭК 74
3.5 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает содержание стресс фибрилл актина в ЭК 77
3.6 Т-кадгерин изменяет экспрессию Р-катенина, но не VE-кадгерина 80
3.7 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя 86
3.8 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин. Анализ экспрессии Т-кадгерина в клонах 88
3.9 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает связывание 1251-ЛНП с мембранами клеток L929 и НЕК293 89
3.10 Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция 93
3.11 ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин 102
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 104
Выводы 124
Список литературы 126
