Введение
2 Обзор литературы 10
2.1 Общие сведения о митозе 10
2.1.1 Фазы митоза и строение митотического аппарата 10
2.1.2 Микротрубочки 13
2.1.3 Общие сведения о кинетохоре
2.2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор 16
2.3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора 16
2.4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora B играет ключевую роль в установлении биориентации хромосом 19
2.5 Комплекс NDC80 – важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки 23
3 Материалы и методы 28
3.1 Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол 28
3.1.1 Изготовление многоразовых проточных камер 28
3.1.2 Подготовка покровных стекол
3.2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80. 32
3.3 Микроскопия полного внутреннего отражения 33
3.4 Анализ данных микроскопии
3.4.1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF микроскопии. 41
3.4.2 Анализ кооперативности NDC80-MT взаимодействия с использованием метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP). 46
3.5 Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ 46
4 Результаты 49
4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора 49
4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки
4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к сайту. 53
4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ. 57
4.2.3 Кооперативность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ. 59
4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro 65
4.3.1 Взаимодействие NDC80 и MT определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Hec1 65
4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1 приводит к градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ. 70
4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Hec1 градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ. 74
4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие NDC80-MT. 80
4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при фосфорилировании хвоста Hec1. 89
4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80. 92
4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну
фосфомиметическая мутацию в хвосте Hec1 комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок. 92
4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления. 93
4.4.3 Алгоритм симуляции 95
4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора 97
4.5 Модель кинетохора, содержащая сайты связывания КМТ не может описать наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при фосфорилировании. 101
4.6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных. 1 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
6 Выводы 109
7 Список сокращений и условных обозначений 110
8 Список литературы 111
