Оглавление
Список сокращений ........................................................................................................ 6
1. Общая характеристика работы .............................................................................. 8
1.1. Актуальность работы ........................................................................................... 8
1.2. Цели и задачи работы ........................................................................................ 11
1.3. Научная новизна полученных результатов ...................................................... 11
1.4. Научно-практическая значимость работы ....................................................... 13
1.5. Положения, выносимые на защиту .................................................................. 14
1.6. Степень достоверности ...................................................................................... 14
1.7. Апробация работы ............................................................................................. 15
1.8. Публикации ........................................................................................................ 15
1.9. Личный вклад автора ......................................................................................... 15
1.10. Структура и объём диссертации ..................................................................... 16
2. Обзор литературы ................................................................................................... 17
2.1. Сперматогенез Drosophila ................................................................................. 17
2.1.1. Общая схема сперматогенеза Drosophila ................................................. 17
2.1.2. Мейоз в семенниках Drosophila .................................................................. 22
2.2. Оогенез Drosophila ............................................................................................. 25
2.3. piРНК-путь – инструмент поддержания гаметогенеза ................................... 28
2.3.1. Биогенез piРНК ............................................................................................ 31
2.3.2. Первичный Zuc-зависимый механизм биогенеза piРНК ........................... 34
2.3.3. Вторичный механизм биогенеза piРНК: амплификационный цикл пинг-
понг ......................................................................................................................... 36
2.3.4. Система Stellate – Supressor of Stellate в сперматогенезе Drosophila
melanogaster ........................................................................................................... 38
3
2.3.5. piРНК-сайленсинг белок-кодирующих генов ............................................. 42
2.4. Межвидовая репродуктивная изоляция у Drosophila. Возможная роль
piРНК-пути ................................................................................................................ 45
2.5. DEAD-box содержащие РНК-хеликазы ........................................................... 49
2.5.1. Структурные характеристики DEAD-box содержащих РНК-хеликаз . 49
2.5.2. Функции DEAD-box содержащих РНК-хеликаз ........................................ 52
2.5.3. DEAD-box содержащая РНК-хеликаза Vasa ............................................. 55
2.6. Молекулярные функции Vasa ........................................................................... 56
2.6.1. Vasa участвует в образовании герминальных клеток у широкого круга
животных .............................................................................................................. 56
2.6.2. Роль Vasa в структуре и динамике герминальных гранул ....................... 58
2.6.3. Половой диморфизм экспрессии и функций Vasa у различных животных
................................................................................................................................. 64
2.6.4. Функции Vasa у Drosophila ......................................................................... 67
2.6.5. Vasa (MVH, Mouse Vasa Homologue) у мышей .......................................... 73
2.6.6. VASA у человека (DDX4) ............................................................................. 81
2.7. Заключение ......................................................................................................... 86
3. Материалы и методы .............................................................................................. 88
3.1. Линии Drosophila, использованные в работе .................................................. 88
3.2. Генетические эксперименты ............................................................................. 90
3.3. Тесты на фертильность самцов Drosophila ...................................................... 91
3.4. Диссекция гонад Drosophila .............................................................................. 92
3.5. Получение осветлённых лизатов, SDS-электрофорез в ПААГ (метод
Лэммли) и Вестерн блот анализ ............................................................................... 92
3.6. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов гонад Drosophila ........... 94
3.7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) .................................................. 95
4
3.8. Конфокальная микроскопия .............................................................................. 96
3.9. Анализ морфологии и учет количества герминальных стволовых клеток в
семенниках Drosophila ............................................................................................. 96
3.10. Антитела, использованные в работе ............................................................... 97
3.11. РНК-иммунопреципитация ............................................................................. 98
3.12. Выделение РНК, получение кДНК методом обратной транскрипции ...... 100
3.13. Количественная ПЦР в реальном времени .................................................. 101
3.14. Оценка количества копий генов Stellate в геноме Drosophila melanogaster
.................................................................................................................................. 102
3.15. Выравнивание повторов AT-chX и генов vasa ............................................. 103
3.16. Получение библиотек коротких РНК ........................................................... 103
4. Результаты ............................................................................................................ 109
4.1. При нарушении экспрессии vasa происходит уменьшение количества
герминальных клеток в семенниках Drosophila melanogaster ............................ 109
4.2. Поиск мишеней Vasa ....................................................................................... 115
4.3. На фоне мутации rhino происходит снижение количества ГСК и
фертильности у самцов Drosophila melanogaster ................................................. 120
4.4. На фоне мутации aub происходит снижение количества ГСК у самцов
Drosophila melanogaster .......................................................................................... 122
4.5. Дополнительная экспрессия rhino на фоне отсутствия Vasa приводит к
восстановлению ранних стадий сперматогенеза .................................................. 126
4.6. Регуляция экспрессии vasa и межвидовая изоляция ..................................... 137
4.6.1. Идентификация и геномный анализ повторов AT-chX .......................... 137
4.6.2. Экспресссия AT-chX в развивающихся сперматоцитах Drosophila
melanogaster ......................................................................................................... 141
5
4.6.3. Биогенез piРНК из локуса AT-chX ............................................................ 143
4.6.4. Путь piРНК не регулирует экспрессию vasa у D. melanogaster ............ 145
4.6.5. AT-chX piРНК подавляют экспрессию vasa в межвидовых гибридах
Drosophila ............................................................................................................. 149
4.6.6. Дерепрессия Stellate в семенниках межвидовых гибридов ..................... 156
5. Обсуждение ............................................................................................................ 159
6. Выводы .................................................................................................................... 168
7. Список использованной литературы .................................................................... 169
8. Благодарности ........................................................................................................ 205
