Введение
2. Обзор литературы 8
2.1 Энтеропептидаза-ключевой фермент пищеварения 8
2.1.1. История открытия и физиологическая роль 8
2.1.2. Структура энтеропептидазы 9
2.1.3. Экспрессия гена энтеропептидазы 13
2.2. Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе , 17
2.2.1. Специфичность сериновых протеиназ 17
2.2.2. Сайты распознавания субстрата 19
2.2.3. Распознавание субстратов вовремя катализа 23
A. Критерии специфичности сериновых протеиназ 23
Б. Специфичность определяется этапами связывания и ацилироваыия 24
B. Вклад в специфичность ассоциации субстрата 25
Г. Следствия, касающиеся специфичности гидролиза сложных эфиров 26
2.2.4. Как удаленные взаимодействия влияют на катализ? 27
A. Дальние взаимодействия выравнивают субстрат в активном центре 28
Б. Удаленные взаимодействия оптимизированы в переходном состоянии 29
B. Удаленные взаимодействия индуцируют конформациоиные изменения, содействующие катализу 30
Г. Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителя
Д. Удаленные взаимодействия связывают катализ с движением структуры протеиназы 31
2.3. Экспрессия рекомбинантиых гибридных белков и их ренатурация 32
2.3.1. Экспрессия рекомбинантиых белков 32
2.3.2. Гибридные (слитные) белки 33
Проблемы при экспрессии слитных белков 34
Расщепление слитных белков 35
Слитные белки с тиоредоксином в качестве белка-носителя 37
2.3.3. Ренатурация рекомбинантиых белков 38
3. Материалы и методы 41
3.1. Материалы 41
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты 41
3.1.2. Штаммы иплазмидиые вектора 42
3.1.3. Питательные среды для роста бактерий , 42
3.1.4. Синтетические олигонуклеотиды 42
3.2, Методы 43
3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК 43
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 44
3.2.3. Электрофорети чес кий анализ ДНК в агарозном геле 44
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК 44
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля 45
3.2.6. Определение нуклеотидыой последовательности (секвенирование) ДНК 45
3.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНКрЕТ-32/L-HEP 45
3.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез 47
3.2.8. Экспрессия гена L-HEP и ее мутантных вариантов 48
3.2.9. Идентификация белков noN-юнцевой последовательности 48
3.2.10. Ренатурация гибридных белков с тиоредоксином в качестве белка-носителя...49
3.2.11. Очистка активной L-HEP и ее мутантных вариантов 50
3.2.12. Определение количества белка в растворах и гелях 51
3.2.13. Измерение каталитической активности L-HEP и ее мутантных вариантов 51
Гидролиз тиоэфира Z-Lys-SBzl 51
Гидролиз специфического субстрата GD4K-na 52
Гидролиз неспецифических хромогенных пептидных субстратов 52
Гидролиз белковых субстратов 53
Вычисление кинетических параметров 53
3.2.14. Реакции ингибирования каталитической акитвности L-БЕР 54
3.2.15. Построение пространственных моделей L-HEP и ее мутантных вариантов 54
3.2.16. Молекулярная динамика каталитических субъединиц энтеропептидаз 55
3.2.17. Оценка мутантных вариантов L-HEP 56
3.2.18. Моделирование взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с
пептидными субстратами 58
4, Результаты и обсуждение 60
4.1. Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы 60
4.2. Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP 61
4.3. Исследование ферментативных свойств L-HEP 63
4.4. Построение пространственной модели L-HEP 71
4.5. Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации 72
4.6. Исследование специфичности L-HEP 77
4.7. Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами 81
4.8. Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q 86
4.9. Заключение 93
Выводы 96
Список литературы 98
